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Spectroscopic studies of iron-sulphur cofactors involved in metal centre assembly and catalysis of metalloproteins
Kulka-Peschke, Catharina Julia
Hydrogenases are metalloproteins that catalyze the reversible conversion of dihydrogen into protons and electrons. Numerous representatives of this metalloenzyme family have been discovered over the last 9 decades that exhibit different properties in terms of activities, bias towards the directionality of the catalytic reaction and tolerance towards oxygen. To understand the molecular basis of these properties, spectroscopic techniques and among them, vibrational spectroscopies, as used in this work, are indispensable tools.
In NAD(H)-linked bidirectional [NiFe] hydrogenases hydrogen oxidation and its reversion are coupled to the redox conversion of nicotinamide adenine dinucleotide, NAD(H). A representative of these so-called soluble hydrogenases (SH) was found in the aerobic H2-oxidizing organism Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1T (Ht). The fact that HtSH remains catalytically active in the presence of O2 and at high temperatures makes it a suitable candidate for biotechnological applications. A recently published study revealed an unusual IR spectrum of the as-isolated (oxidized) sample. It exhibits an IR band in the CO stretching region with an unusually high frequency. To elucidate the origin of this IR band, the active-site structure of oxidized HtSH was investigated in this work. Site-directed mutagenesis yielded variants, in which a glutamate in an active-site cavity was replaced by glutamine, alanine, and aspartate, were analyzed by IR and EPR spectroscopy. After the unprecedented IR band was unambiguously assigned to a CO stretching mode, a recently crystallographically observed active-site structure could be verified as the [NiFe] site motive of a novel resting state. In combination with IR and EPR spectroscopic results computational data further revealed an unprecedented formal NiIV ground state for this state. Taking into account the hexa-coordinated ligand sphere, this novel resting state was termed Ni(IV)r-Hex. Furthermore, a second resting-state structure was found to exist in the oxidized HtSH sample, in which a NiIII ground state (termed Ni(III)r-Hex) is coordinated by six ligands. Functional investigations revealed a reversible formation of the Ni(IV)r-Hex state under aerobic conditions, which allowed to conclude that its kinetically controlled formation is part of a specific electronic response toward O2 in order to protect the enzyme from oxidative damage. The combination of RR and IR spectroscopy further allowed to preliminarily assign an additional catalytically active state (Nia-L) for HtSH.
The [FeFe] hydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii (CrHydA1) represents one of the most efficient catalysts known for hydrogen conversion. Thus, despite its oxygen-sensitivity, it is a candidate for bioinspired catalyst design, and the molecular basis of the high catalytic efficiency needs to be elucidated. Following previously published works, the present study analyzed illuminated samples by EPR and cryogenic IR spectroscopy. This approach revealed two previously unknown hydride states (Hhyd:red and Hhyd:ox). Within these investigations the novel active-site structures were spectroscopically characterized and spectral marker bands (re)assigned. With regard to the catalytic mechanism, both states could be incorporated into the commonly accepted cycle for [FeFe] hydrogenases.
Other metalloproteins containing iron–sulfur (FeS) clusters were further investigated using RR spectroscopy. This approach allowed to contribute to other research projects including (1) a protein complex, which is attributed to the mitochondrial FeS protein biogenesis system (GLRX5-BOLA1), as well as (2) a newly found nitrogenase-like enzyme (CfbC2D2), and (3) a recently crystallographically characterized (double cubane cluster containing) enzyme (DCCPCh) catalyzing the reduction of small molecules. Published RR data of well-characterized [2Fe2S] and [4Fe4S] clusters allowed to analyze the samples and assign the cluster types embedded in the first two metalloproteins. This approach further revealed an all-cysteine ligation for the [4Fe4S] cluster and a four-thiol ligation motive in case of the [2Fe2S] cluster. The third protein included an unprecedented complex FeS cluster that was characterized by RR spectroscopy for the first time. The experimental spectra and preliminary theoretical calculations on the basis of a Broken Symmetry-Density Functional Theory approach allowed for the tentative assignment of a RR signal to the characteristic cubane-cluster linking Fe–S–Fe mode.
Hydrogenasen sind Metalloproteine, die die reversible Umwandlung von H2 in Protonen und Elektronen katalysieren. In den letzten neun Jahrzehnten wurden zahlreiche Vertreter dieser Metalloenzym-Familie entdeckt, die unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf Aktivitäten, die Richtung der katalytischen Reaktion und Sauerstoffempfindlichkeit aufweisen. Für das Verständnis der molekularen Basis dieser Eigenschaften sind spektroskopische Methoden und dabei vor allem die Schwingungsspektroskopie unverzichtbar.
Bei NAD(H)-verknüpften bidirektionalen [NiFe]-Hydrogenasen ist die reversible Spaltung von Wasserstoff mit der Redoxreaktion von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, NAD(H), gekoppelt. Ein Vertreter dieser auch als lösliche Hydrogenasen (SH) bezeichneten Enzyme stammt aus dem aeroben H2-oxidierenden Organismus Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1T (Ht). Seine Toleranz gegenüber Sauerstoff und hohen Temperaturen macht diesen Biokatalysator zu einem geeigneten Kandidaten für biotechnologische Anwendungen. Eine erste spektroskopische Charakterisierung zeigte im Bereich der CO-Streckschwingungen eine IR-Bande mit einer ungewöhnlich hohen Frequenz, deren Ursprung in dieser Arbeit untersucht wurde. Durch ortsspezifische Mutagenese wurden Varianten, bei denen ein Glutamat im Bereich des aktiven Zentrums durch Glutamin, Alanin und Aspartat ersetzt wurde, mittels IR- und EPR-Spektroskopie analysiert. Nachdem die ungewöhnliche IR-Bande eindeutig einer CO-Streckungsmode zugeordnet wurde, konnte das kürzlich vorgeschlagene Kristallstrukturmodell des aktiven Zentrums als neuartiger Resting-State verifiziert werden. In Kombination mit den Ergebnissen aus IR- und EPR-spektroskopischen Untersuchungen ergaben berechnete Daten einen formalen NiIV-Grundzustand, der erstmals bei Hydrogenasen beobachtet und unter Berücksichtigung der hexa-koordinierten Ligandensphäre als Ni(IV)r-Hex bezeichnet wurde. Darüber hinaus wurde in der oxidierten HtSH-Probe ein zweiter sechsfach-koordinierter Resting-State mit einem NiIII-Grundzustand gefunden (Ni(III)r-Hex). Untersuchungen der Funktionalität zeigten eine reversible Bildung des Ni(IV)r-Hex-Zustands unter aeroben Bedingungen, was den Schluss zulässt, dass seine kinetisch kontrollierte Bildung Teil einer spezifischen elektronischen Reaktion auf O2 ist, um das Enzym vor oxidativen Schäden zu schützen. Die Kombination von RR- und IR-Spektroskopie ermöglichte es außerdem, einen zusätzlichen katalytisch aktiven Zustand (Nia-L) im HtSH vorläufig zuzuordnen.
Die [FeFe]-Hydrogenase aus Chlamydomonas reinhardtii (CrHydA1) ist einer der effizientesten Katalysatoren für die Wasserstoffumwandlung, was dieses Enzym trotz seiner hohen Sauerstoffsensitivität zu einer attraktiven Vorlage für bioinspiriertes Katalysatordesign macht und damit die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen auf molekularer Ebene motiviert. Kürzlich publizierten Untersuchungen folgend, wurden in dieser Arbeit photoaktivierte Proben mit EPR und IR Spektroskopie bei tiefen Temperaturen analysiert. Auf diese Weise wurden zwei bisher unbekannte Hydridzustände (Hhyd:red und Hhyd:ox) entdeckt. Im Rahmen dieser Studie wurden die neuartigen Spezies spektroskopisch charakterisiert und die spektralen Markerbanden neu zugeordnet. Im Hinblick auf den katalytischen Mechanismus konnten beide Zustände in den allgemein akzeptierten Reaktionsmechanismus für [FeFe]-Hydrogenasen eingefügt werden.
Andere Metalloproteine, die Eisen-Schwefel-Cluster (FeS) enthalten, wurden mittels RR-Spektroskopie untersucht und die Ergebnisse in Kooperationsprojekte integriert. Dazu gehörten (1) ein Proteinkomplex, der dem mitochondrialen FeS-Protein-Biogenesesystem (GLRX5-BOLA1) zugeordnet wird, sowie (2) ein neu entdecktes nitrogenaseähnliches Enzym (CfbC2D2) und (3) ein kürzlich kristallographisch charakterisiertes (double cubane cluster enthaltendes) Enzym (DCCPCh), das die Reduktion kleiner Moleküle katalysiert. Veröffentlichte RR-Daten von gut charakterisierten [2Fe2S]- und [4Fe4S]-Clustern ermöglichten die Zuordnung der in den ersten beiden Metalloproteinen eingebetteten Clustertypen. Dieser Ansatz ergab eine reine Cystein-Bindung für den [4Fe4S]-Cluster und ein Vier-Thiol-Bindungsmotiv im Falle des [2Fe2S]-Clusters. Das dritte Protein enthielt einen in der Natur bislang einmaligen, komplexen FeS-Cluster, der zum ersten Mal durch RR-Spektroskopie charakterisiert wurde. Die experimentellen Spektren und vorläufige theoretische Berechnungen auf der Grundlage eines Ansatzes der Broken Symmetry-Density Functional Theory erlaubten die vorläufige Zuordnung eines RR-Signals zu der charakteristischen verbrückenden Fe-S-Fe-Mode.
References
