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Entwicklung von gfp-basierten Monitoring Tools zur Verfolgung von horizontalem Gentransfer und Studien zum T4SLS des konjugativen Plasmids pIP501 aus Enterococcus faecalis
Arends, Karsten
Die Entstehung multi-resistenter Bakterien stellt eine immer größer werdende Gefahr für den Menschen dar. Hauptsächlich über bakterielle Konjugation findet ein horizontaler Austausch von Antibiotikaresistenz- und Virulenzgenen statt. Während aber der Mechanismus der Konjugation in Gram negativen Bakterien intensiv untersucht worden ist, sind Erkenntnisse zur Konjugation in Gram positiven Bakterien erst in den letzten Jahren entstanden. Als Modell für den konjugativen Transfer in G+ Bakterien diente in dieser Studie das konjugative, multi-resistente Plasmid pIP501 aus Streptococcus agalactiae, das einen ausgesprochen weiten Wirtsbereich hat. Zur Detektion und Verfolgung von horizontalem Gentransfer wurden auf Basis der pIP501 tra Region GFP-markierte, mobilisierbare und konjugative Plasmide konstruiert. Hierfür wurden die oriTpIP501 Region und die oriT-spezifische Relaxase bzw. die gesamte trapIP501 Region sowie ein optimiertes gfp Gen in die shuttle Vektoren pMSP3535 und pMSP3535VA unter Kontrolle des durch Nisin induzierbaren Promotors nisA kloniert. Für ein proof of principle wurde das mobilisierbare, GFP-markierte Plasmid pVA-GFP in bi- und triparentalen Kreuzungen mit pIP501 als konjugativem Plasmid von Enterococcus faecalis in verschiedene Bakterienstämme mobilisiert. Für eine molekulare Analyse des Mobiloms G+ Bakterien wurden PCR Assays zum Nachweis von pSK41/pGO1- und pIP501-ähnlichen Transfergenen sowie verschiedener MOBV, MOBQ und MOBP Relaxasen erstellt. In dem klinischen Isolat E. faecalis T9 wurden pSK41-ähnliche Transfergene nachgewiesen. Es konnte eine Retromobilisierung des Plasmids pVA GFP von E. faecalis OG1X nach E. faecalis T9 und eine Mobilisierung des Plasmids pVA-GFP von E. faecalis T9 nach Bacillus subtilis gezeigt werden. Im zweiten Teil der Dissertation konnten 9 der 15 pIP501 Tra Proteine über Zellfraktionierungen von E. faecalis JH2-2 (pIP501) in vivo lokalisiert werden. Bis auf Orf14, das zytoplasmatisch vorlag, lokalisierten alle weiteren untersuchten Tra Proteine in der Zellhülle von E. faecalis. Für Orf8 und Orf11 konnte eine Lokalisierung in vivo über STED Immunfluoreszenzmikroskopie erfolgen. Orf8 bildete Foci in der Zellhülle von E. faecalis, während Orf11 zufällig verteilt in der gesamten Zellhülle vorlag. Die DNA-Bindung der Tra Proteine Orf8, Orf10, Orf11 und Orf14 wurde mit Gelshiftexperimenten untersucht. Orf10 zeigte spezifische Bindung an einzelsträngige DNA, während Orf14 bevorzugt mit doppel-strängige DNA interagierte. Bindungen von Orf11 an doppel- und einzelsträngige DNA konnten nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die VirB1-ähnliche lytische Transglykosylase Orf7 essentiell für den konjugativen Transfer von pIP501 ist. Mit den erhaltenen Daten wurde das T4SLS Arbeitsmodell für pIP501 modifiziert.
The emergence of multiple antibiotic-resistant bacteria is an increasing threat for the human health. The dissemination of antibiotic resistance and virulence genes mainly occurs horizontally by bacterial conjugation. But whereas the conjugation mechanisms have been studied intensively for Gram negative species, the knowledge of horizontal gene transfer through conjugation is still limited for Gram positive bacteria. In this study the conjugative broad host-range plasmid pIP501 originally isolated from Streptococcus agalactiae was used as a model for conjugative plasmid transfer in Gram positive bacteria. Based on the pIP501 tra region GFP-tagged mobilizable and conjugative plasmids were constructed using E. coli shuttle vectors. The gene for the green fluorescent protein (GFP) and the pIP501 oriT region as well as the oriT specific relaxase gene orf1 and the whole tra region, respectively, were cloned into the E. coli shuttle vectors pMSP3535 and pMSP3535VA under control of a Nisin inducible nisA promoter. For a proof of principle bi- and triparental matings were performed from Enterococcus faecalis to different species (Enterococcus, Bacillus, Escherichia) as recipient using the mobilizable plasmid pVA-GFP and the conjugative plasmid pIP501. PCR based assays were established for the molecular detection of pSK41/pGO1- and pIP501- like transfer genes and MOBV, MOBQ and MOBP relaxase genes in Gram positive bacteria. Mobilome analysis revealed the presence of pSK41/pGO1-like genes (nes, traE/G/K) in the clinical strain E. faecalis T9. The strain was used to retromobilize the plasmid pVA-GFP from E. faecalis OG1X to E. faecalis T9. Subsequently the obtained transconjugant E. faecalis T9 (pVA-GFP) was used to mobilize the plasmid pVA-GFP to Bacillus subtilis. In the second part of this thesis 9 of 15 pIP501 Tra proteins were localized in vivo by fractionation of E. faecalis JH2-2 (pIP501) cell compartments. Except for Orf14, which was exclusively found in the cytoplasm of E. faecalis JH2-2, the Tra proteins localized in the cell envelope of E. faecalis. The spatial distribution of the Tra proteins Orf8 and Orf11 was analysed by STED immuno-fluorescence microscopy. Orf8 formed punctate foci whereas Orf11 was distributed uniformly in the cell envelope of E. faecalis. Gel-shift experiments revealed DNA binding for the Tra proteins Orf10, Orf11 and Orf14, but no protein-DNA interaction was observed for Orf8. Orf10 bound preferably to single-stranded DNA, Orf14 showed a strong binding to double-stranded DNA and Orf11 bound to double- and single-stranded DNA without any preferences. The VirB1-like Orf7 was demonstrated to be essential for the pIP501 conjugative transfer. The obtained data was used to modify the pIP501 T4SLS working model.
