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Membrane-Inlet Mass Spectrometry Studies of Natural and Artificial Photosynthesis
Beckmann, Katrin
Die oxygene Photosynthese ist die Lebensgrundlage der heterotrophen Organismen, da sie den lebensnotwendigen molekularen Sauerstoff und fast alle Nährstoffe liefert. Das katalytische Zentrum der photosynthetischen Wasserspaltungsreaktion wird als Sauerstoff-entwickelnder Komplex (OEC, englisch: oxygen evolving complex) bezeichnet und befindet sich an der luminalen Seite des Protein-Pigment-Komplexes Photosystem II (PSII). Der OEC besteht aus einem anorganischen, (x)-Sauerstoff-verbrücktem (x ≥ 5) tetra-Mangan-Calcium (Mn4OxCa)-Komplex und einer speziefischen Proteinumgebung, die nicht nur die anorganischen Komponenten bindet, sondern auch den protonengekoppelten Elektronen-transport, die Substratzufuhr und auch den Produktausstoß reguliert. Im Mn4OxCa-Komplex werden, angetrieben von lichtinduzierten Ladungstrennungen im chlorophyll-haltigen Reaktionszentrum von PSII, fünf Redoxzustände schrittweise durchlaufen. Diese Redoxintermediate werden als Si-Zustände bezeichnet, wobei der Index (i = 0 – 4) die Zahl der gespeicherten Oxidationsäquivalenten angibt. In der vorliegenden Arbeit wird die photosynthetische Wasserspaltung mit Hilfe von zeitaufgelöster Membraneinlass-Massenspektrometer (MIMS, englisch: membrane-inlet mass spectrometry) und Isotopenmarkierung detailliert untersucht. MIMS erlaubt eine direkte Verbindung zwischen Reaktionsgefäß und Massenspektrometer (MS), wobei eine gasdurchlässige Membran die Probe vom Hochvakuum des MS trennt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Membraneinlasssysteme konstruiert und damit folgende Ergebnissen erzielt: 1) Durch Messung der H216O/H218O-Substratwasseraustauschkinetiken von PSII-Proben, deren natürliche Kofaktoren Ca2+ und Cl− durch Sr2+ und/oder Br− ersetzt waren, wurde gezeigt, dass sowohl Ca2+/Sr2+ als auch Cl−/Br− Austausch die langsame Phase des Substratwasseraustausches beschleunigt. Für diese Experimente wurden Thylakoide verwendet, die aus dem thermophilen Cyanobakterium Thermosynechoccus eleongatus isoliert wurden, dessen Anzuchtsmedien entweder CaCl2, CaBr2, SrCl2 oder SrBr2 enthielten. 2) Sauerstoffdrücke bis 20 bar haben keinen detektierbaren Einfluss auf die lichtinduzierte Sauerstoffbildungsaktivität von Thylakoiden und PSII-Membranfragmenten. Hiermit konnte eine in der Literatur beschriebene Produktinhibition von PSII, auf die aus indirekteren UV-Absorptionsmessungen geschlossen wurde, nicht bestätigt werden. 3) Hydrogencarbonat ist nicht das Substrat für die O2-Bildung im PSII. Diese Ergebnisse räumen letzte mögliche Zweifel daran aus, dass tatsächlich Wasser, und nicht Hydrogencarbonat, das direkte Substrat der photosynthetischen Wasserspaltung ist. 4) In einer vergleichenden Studie der Wasserspaltungsaktivität von verschiedenen synthetischen Mn-Verbindungen wurde erstmals ein Mn-Dimer gefunden, das bei Zugabe von zwei unterschiedlichen chemischen Oxidationsmitteln (Oxone oder Bleitetraacetat) Sauerstoff mit der korrekten Isotopenmarkierung von H218O-angereichertem Wasser produziert. Diese O2-Freisetzung war allerdings substoichiometrisch, und bei weiteren Zugaben von Oxone veränderte sich die Isotopenzusammensetzung des freigestzten O2 hin zu der des unmarkierten Oxones. Dennoch könnte dies ein erster Schritt hin zu der Entwicklung von artifiziellen Wasserspaltungskatalysatoren sein.
Oxygenic photosynthesis provides molecular oxygen and nearly all vital nutrients for heterotrophic organisms. The catalytic center for the generation of molecular oxygen from the photosynthetic oxidation of water is termed oxygen evolving complex (OEC). It is located on the luminal site of the protein-pigment complex Photosystem II (PSII). The OEC consists of an inorganic, x-oxygen bridging (x ≥ 5) tetra-manganese-calcium (Mn4OxCa) complex and its specific protein surrounding. The protein matrix does not only bind the inorganic components but also regulates the proton coupled electron transfer, substrate supply and product release. The Mn4OxCa complex passes stepwise through five redox states. The redox intermediates are termed Si states with the index (i = 0 – 4) giving the number of stored oxidizing equivalents. The reaction is driven by light induced charge separation in the chlorophyll containing reaction center of PSII. In the present work the photosynthetic water splitting reaction is studied in detail by time-resolved membrane-inlet mass spectrometry (MIMS) and isotopic labeling. MIMS enables a direct connection between reaction vessel and mass spectrometer (MS), because a gas permeable membrane separates the sample from the high vacuum of the MS. Within the scope of this work diverse PSII-systems were constructed and the following results were obtained by MIMS: 1) Measurements of H216O/H218O-substrate water exchange kinetics of PSII samples, in which the natural cofactors Ca2+ and Cl- have been substitute for Sr2+ and/or Br-, showed that Ca2+/Sr2+ as well as Cl-/Br- substitution accelerate the slow phase of substrate water exchange. For these experiments, thylakoids were isolated from the thermophilic cyanobacterium Thermosynechoccus eleongatus, which were grown either in medium containing CaCl2, CaBr2, SrCl2 or SrBr2. 2) Oxygen pressure of up to 20 bar has no detectable influence on the light induced oxygen evolving activity of thylakoids and PSII membrane fragments. Hereby, a product inhibition of PSII, which was described in the literature and shown by indirect UV absorption measurements, was proven wrong. 3) Hydrogen carbonate is not the substrate for the photosynthetic oxygen production in PSII. This result clears out last doubts, that water and not hydrogen carbonate is the direct substrate of the photosynthetic water splitting reaction. 4) Artificial solar water splitting is a promising approach towards the production of renewable energy carriers. In a study comparing water splitting activities of diverse synthetic Mn-compounds, a Mn-dimer was firstly found that generates O2 in accordance with the H218O-enriched water, closely resembling the theoretical values for true water oxidation upon addition of different chemical oxidants (oxone and lead tetraacetate). The oxygen evolution with lead tetraacetate was substoichiometric and also further addition of oxone changed the isotopic composition of the produced oxygen towards unlabelled oxone. Nevertheless, this could be a first step towards the development of artificial water splitting catalysts.
