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Multi-omics analysis of Aspergillus niger glucoamylase producing strains and exploration of NADPH metabolic engineering

Sui, Yufei

The filamentous fungus Aspergillus niger is one of the main cell factories used nowadays in the industry for homologous or heterologous protein production due to its extraordinary ability for protein expression and secretion. Systematic comprehension of its metabolic regulation characteristics during the fermentation process is of considerable significance to improve the performance of this versatile cell factory through metabolic engineering. From the perspective of genomics, time-course transcriptome analysis and cofactor engineering, this thesis deciphered the high efficient enzyme production mechanism in A. niger and successfully optimized its enzyme capability through metabolic engineering. As previous studies reported that reduced sporulation favors protein secretion in A. niger, in this thesis we conducted a comparative genomic analysis of the non-sporulating industrially exploited A. niger strain LDM3 in China and the reference protein secretion strain CBS 513.88 to predict the key genes that might define the genetic basis of LDM3’s high protein producing potential in silico. After assembly, LDM3 harbors 11,209 open reading frames (ORFs) and exhibits large chromosomal rearrangements in comparison to CBS 513.88. An alignment of the two genome sequences revealed that the majority of the 457 ORFs uniquely present in LDM3 possessed predicted functions in redox pathways, protein transport, and protein modification processes. In addition, bioinformatic analyses revealed the presence of 656 ORFs in LDM3 with non-synonymous mutations encoding for proteins related to protein translation, protein modification, protein secretion, metabolism, and energy production. Based on available literature and co-expression network analysis, tupA was proposed as the key factor involved in asexual sporulation of A. niger. By knockout experiments, we showed that the ΔtupA mutant displayed reduced sporulation (35%) accompanied by higher total protein secretion (65%) compared to its parental strain. Such an effect was, however, not observed in the ΔprpA mutant. Oxygen limitation is a profitable strategy for industrial glucoamylase (GlaA) overproduction by A. niger. To deepen the understanding of how the transcriptional network responded to the oxygen limitation during the industrial glucoamylase fermentation, time-course transcriptome samples from the fed-batch cultures of a high-yield GlaA producing A. niger strain DS03043 were sequenced. Gene expression pattern analysis of 515 identified differentially expressed genes (DEGs) suggested a highly flexible metabolism when the cell coped with the hypoxic status. Along with the limited biomass growth caused by the low oxygen availability, it led to a weakened biosynthesis of cell protein, but fatty acid catabolism, GlaA biosynthesis, and the provision of precursor amino acids were notably activated. Above proofs underline that cellular resources, such as energy substrates and precursors metabolites, were prioritized to the highly efficient GlaA accumulation under the low energy supply condition. Noteworthy, the defined sterol-regulatory element-binding proteins (SREBP) transcription factor SrbB continuously and dramatically up-regulated during the entire cultures, indicating an essential regulatory role of SrbB in the transcriptional adaption to the hypoxia. Our recent multi-omics analyses of glucoamylase (GlaA) biosynthesis in the filamentous fungal cell factory A. niger indicated that low availability of NADPH might be a limiting factor for GlaA overproduction. Given the prediction of GSMM and available literature, we selected in a total of nine predicted NADPH regeneration enzymes in A. niger to test their individual effects on glucoamylase and total protein production in the lab established A. niger strain AB4.1 (only carrying one copy of glucoamylase encoding gene glaA). In doing so, we integrated an additional copy of these genes under the control of the strong and tunable gene Tet-on switch into the pyrG locus of A. niger. However, albeit intracellular NADPH supply was slightly improved after genetic perturbation in AB4.1, no significant alteration was observed on protein biosynthesis. Hence, the NADPH supply could not be the bottleneck for protein production because of the low NADPH requirement in AB4.1. In vitro CRISPR/Cas9 system has aroused extensive academic attention due to its high gene editing efficiency but weakened off-target possibility. This thesis adopted the optimized in vitro A. niger CRISPR/Cas9 system using the ribonucleoprotein (RNP) approach to efficiently construct the uridine auxotrophic mutant of a high-yield GlaA producing strain A. niger B36, so as to provide an excellent platform for further NADPH engineering under a high protein secretion background. The classic Design-Build-Test-Learn (DBTL) cycle of metabolic engineering is increasingly leveraged to advance rational strain development. To understand if a strong pull towards glaA biosynthesis (seven gene copies) mandates a higher proteinogenic NADPH supply compared to the native condition, we reported on the implementation of DBTL cycles to identify and prioritize effective co-factor engineering strategies in a high-yield GlaA producer B36 carrying seven glaA gene copies. Detailed analysis of all seven identical NADPH regeneration systems as in AB4.1 in shake flask cultures uncovered that Tet-on driven overexpression of the gsdA gene (glucose 6-phosphate dehydrogenase), gndA gene (6-phosphogluconate dehydrogenase) and maeA gene (NADP-dependent malic enzyme) supported GlaA production on a subtle but significant level (10%) in the background strain which carries seven glaA gene copies. We thus performed maltose-limited chemostat cultures for these three isolates to determine the intracellular NADPH pool during steady-state conditions. In these cultures, overexpression of gndA and maeA gene increased the intracellular NADPH pool by 45% and 66%, and the yield of GlaA by 65% and 30%, respectively. Nevertheless, overexpression of gsdA gene had a negative effect on both total protein and glucoamylase production. This data suggests for the first time that increased NADPH availability can indeed underpin protein and especially GlaA production in strains where a strong pull towards GlaA biosynthesis exists. We thus propose that NADPH cofactor engineering is indeed a valid strategy for metabolic engineering of A. niger to improve GlaA production, a strategy which is certainly also applicable to the rational design of other microbial cell factories.
Der Fadenpilz Aspergillus niger ist aufgrund seiner außergewöhnlichen Fähigkeit zur Proteinexpression und -sekretion eine der wichtigsten Zellfabriken, die heutzutage in der Industrie für die homologe oder heterologe Proteinproduktion verwendet werden. Das systematische Verständnis seiner Stoffwechselregulationseigenschaften während des Fermentationsprozesses ist von erheblicher Bedeutung, um die Leistung dieser vielseitigen Zellfabrik durch metabolisches Engineering zu verbessern. Aus der Sicht der Genomik, der Zeitverlaufs-Transkriptomik-Analyse und des Cofaktor-Engineerings entschlüsselte diese Arbeit den hocheffizienten Enzymproduktionsmechanismus in A. niger und optimierte erfolgreich seine Enzymfähigkeit durch metabolisches Engineering. Da frühere Studien berichteten, dass eine verringerte Sporulation die Proteinsekretion in A. niger begünstigt, führten wir in dieser Arbeit eine vergleichende Genomanalyse des nicht sporulierenden industriell genutzten A. niger Stammes LDM3 in China und des Referenzproteinsekretionsstamms CBS 513.88 durch, um den Schlüssel vorherzusagen Gene, die genetische Basis des hohen Proteinproduktionspotentials von LDM3 in silico definieren könnten. Nach dem Zusammenbau enthält LDM3 11.209 offene Leserahmen (ORFs) und weist im Vergleich zu CBS 513.88 große chromosomale Umlagerungen auf. Ein Alignment der beiden Genomsequenzen ergab, dass die Mehrheit der in LDM3 eindeutig vorhandenen 457 ORFs vorhergesagte Funktionen in Redoxwegen, Proteintransport- und Proteinmodifikationsprozessen besaß. Darüber hinaus zeigten bioinformatische Analysen das Vorhandensein von 656 ORFs in LDM3 mit nicht synonymen Mutationen, die für Proteine kodieren, die mit Proteintranslation, Proteinmodifikation, Proteinsekretion, Metabolismus und Energieproduktion zusammenhängen. Basierend auf der verfügbaren Literatur und der Analyse des Koexpressionsnetzwerks wurde tupA als Schlüsselfaktor für die asexuelle Sporulation von A. niger vorgeschlagen. Durch Knockout-Experimente zeigten wir, dass die ΔtupA-Mutante eine verringerte Sporulation (35%) zeigte, begleitet von einer höheren Gesamtproteinsekretion (65%) im Vergleich zu ihrem Elternstamm. Ein solcher Effekt wurde jedoch bei der ΔprpA-Mutante nicht beobachtet. Die Sauerstoffbegrenzung ist eine rentable Strategie für die Überproduktion von industrieller Glucoamylase (GlaA) durch A. niger. Um das Verständnis darüber zu vertiefen, wie das Transkriptionsnetzwerk auf die Sauerstoffbegrenzung während der industriellen Glucoamylase-Fermentation reagierte, wurden Zeitverlaufstranskriptomproben aus den Fed-Batch-Kulturen eines GlaA-produzierenden A. niger-Stamms DS03043 mit hoher Ausbeute sequenziert. Die Analyse des Genexpressionsmusters von 515 identifizierten differentiell exprimierten Genen (DEGs) deutete auf einen hochflexiblen Metabolismus hin, wenn die Zelle mit dem hypoxischen Status fertig wurde. Zusammen mit dem begrenzten Wachstum der Biomasse, das durch die geringe Sauerstoffverfügbarkeit verursacht wurde, führte dies zu einer geschwächten Biosynthese des Zellproteins, aber der Fettsäurekatabolismus, die GlaA-Biosynthese und die Bereitstellung von Vorläuferaminosäuren wurden insbesondere aktiviert. Die obigen Beweise unterstreichen, dass zelluläre Ressourcen wie Energiesubstrate und Vorläufer-Metaboliten der hocheffizienten GlaA-Akkumulation unter Bedingungen niedriger Energieversorgung Vorrang einräumen. Bemerkenswert ist, dass der definierte Transkriptionsfaktor SrbB für sterolregulatorische elementbindende Proteine (SREBP) während der gesamten Kulturen kontinuierlich und dramatisch hochreguliert wird, was auf eine wesentliche regulatorische Rolle von SrbB bei der Transkriptionsanpassung an die Hypoxie hinweist. Unsere kürzlich durchgeführten Multi-Omics-Analysen der Biosynthese von Glucoamylase (GlaA) in der Fabrik für filamentöse Pilzzellen A. niger zeigten, dass eine geringe Verfügbarkeit von NADPH ein begrenzender Faktor für die Überproduktion von GlaA sein könnte. Angesichts der Vorhersage von GSMM und der verfügbaren Literatur haben wir insgesamt neun vorhergesagte NADPH-Regenerationsenzyme in A. niger ausgewählt, um ihre individuellen Auswirkungen auf die Glucoamylase und die Gesamtproteinproduktion im im Labor etablierten A. niger-Stamm AB4.1 (mit nur eine Kopie der für das Gen glaA kodierenden Glucoamylase). Dabei haben wir eine zusätzliche Kopie dieser Gene unter der Kontrolle des starken und abstimmbaren Tet-on-Schalters des Gens in den pyrG-Locus von A. niger integriert. Obwohl die intrazelluläre NADPH-Versorgung nach genetischer Störung in AB4.1 leicht verbessert war, wurde keine signifikante Veränderung der Proteinbiosynthese beobachtet. Daher könnte die NADPH-Versorgung aufgrund des geringen NADPH-Bedarfs in AB4.1 nicht der Engpass für die Proteinproduktion sein. Das In-vitro-CRISPR/Cas9-System hat aufgrund seiner hohen Effizienz bei der Geneditierung, jedoch einer Schwächung der Möglichkeit außerhalb des Ziels, umfangreiche akademische Aufmerksamkeit erregt. In dieser Arbeit wurde das in vitro optimierte A. niger CRISPR / Cas9 unter Verwendung des Ribonukleoprotein (RNP) -Ansatzes übernommen, um die auxotrophe Uridinmutante eines GlaA-produzierenden Stamms A. niger B36 mit hoher Ausbeute effizient zu konstruieren und so eine hervorragende Plattform für weiteres NADPH bereitzustellen Engineering unter einem Hintergrund mit hoher Proteinsekretion. Der klassische DBTL-Zyklus (Design-Build-Test-Learn) des Metabolic Engineering wird zunehmend genutzt, um die rationale Stammentwicklung voranzutreiben. Um zu verstehen, ob eine starke Tendenz zur GlaA-Biosynthese (sieben Genkopien) eine höhere proteinogene NADPH-Versorgung im Vergleich zum nativen Zustand erfordert, berichteten wir über die Implementierung von DBTL-Zyklen, um effektive Co-Faktor-Engineering-Strategien in einem GlaA mit hoher Ausbeute zu identifizieren und zu priorisieren Produzent B36 mit sieben glaA-Genkopien. Eine detaillierte Analyse aller sieben identischen NADPH-Regenerationssysteme wie in AB4.1 in Schüttelkolbenkulturen ergab, dass eine Tet-on-gesteuerte Überexpression des gsdA-Gens (Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase), des gndA-Gens (6-Phosphogluconat-Dehydrogenase) und des maeA-Gens (NADP) auftrat -abhängiges Äpfelsäureenzym) unterstützte die GlaA-Produktion auf einem subtilen, aber signifikanten Niveau (10%) im Hintergrundstamm, der sieben glaA-Genkopien trägt. Wir führten daher für diese drei Isolate Maltose-limitierte Chemostat-Kulturen durch, um den intrazellulären NADPH-Pool unter stationären Bedingungen zu bestimmen. In diesen Kulturen erhöhte die Überexpression des gndA- und des maeA-Gens den intrazellulären NADPH-Pool um 45% und 66% und die Ausbeute an GlaA um 65% bzw. 30%. Trotzdem hatte die Überexpression des gsdA-Gens einen negativen Einfluss auf die Gesamtprotein- und Glucoamylase-Produktion. Diese Daten legen zum ersten Mal nahe, dass eine erhöhte Verfügbarkeit von NADPH tatsächlich die Protein- und insbesondere die GlaA-Produktion in Stämmen untermauern kann, in denen ein starker Zug zur GlaA-Biosynthese besteht. Wir schlagen daher vor, dass das NADPH-Cofaktor-Engineering tatsächlich eine gültige Strategie für das metabolische Engineering von A. niger zur Verbesserung der GlaA-Produktion ist, eine Strategie, die sicherlich auch auf das rationale Design anderer mikrobieller Zellfabriken anwendbar ist.