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Characterization and optimization of Thermothelomyces thermophilus as fungal production host

Siebecker, Benedikt

Thermothelomyces thermophilus is a thermophilic, filamentous fungus, and a very efficient natural producer of hydrolases, like lignocellulolytic enzymes. To optimize this fungus as a production host for hydrolases and heterologous proteins, the understanding of hydrolase expression and regulation is of great interest. With that the expression of specific hydrolases could either be enhanced for applications in, e.g. biorefineries or lowered to increase yield and purity of heterologously expressed proteins. Therefore, this dissertation aimed to 1) establish and apply molecular biological methods to delete regulators of cellulase expression, 2) establish and perform bioreactor cultivations with subsequent biochemical analyses of the above-mentioned strains, and 3) analyze the transcriptome with a focus on hydrolase expression and regulation. Molecular biological methods were established and successfully used to delete known regulators of cellulase expression (Clr1, Clr2, Clr4, and Vib1) and a potentially new one (Vib2). The split marker approach was applied to delete the genes clr2 and vib2, whereas clr4 and vib1 were deleted via the newly established CRISPR/Cas12a system. Deletion of clr1 required the simultaneous use of the split marker approach and the CRISPR/Cas12a system. Bioreactor cultivations in batch or chemostat operation were successfully established. This allows studies on T. thermophilus under controlled, industrially relevant conditions. The transcriptomic analysis revealed a strong expression of genes encoding for predicted lignocellulolytic enzymes including cellulases, hemicellulases, pectinases, and esterases in response to cellulose. Almost all predicted LPMO genes were strongly expressed as well, supporting the application of T. thermophilus in biorefineries. In addition, the analysis uncovered highly expressed predicted protease genes and so far uncharacterized potential regulators of lignocellulolytic enzyme expression. These can be deleted or overexpressed to optimize T. thermophilus for industrial applications. Furthermore, the role of the T. thermophilus orthologs of known regulators of plant biomass degradation was examined in detail, revealing the essential function of the regulators Clr1 and Clr2 for cellulase expression. The expression of clr2 and therefore the complete lignocellulolytic response to cellulose was observed to be Clr1 dependent. Moreover, the data indicate that the regulator Clr4, which was recently published to be an activator of cellulase expression, functions as a repressor, instead. Here, the deletion was leading to a higher gene expression of predicted lignocellulolytic enzymes and corresponding regulators (e.g. Clr2). Furthermore, the function of the potentially new regulator Vib2 was investigated and revealed a repressing function in the early lignocellulolytic response to cellulose. The deletion mutant of vib1 showed growth defects on many carbon sources including cellulose on solid medium, whereas cellulose was successfully utilized during submerged cultivation. The transcriptome of that mutant was not analyzed in this study. Finally, the data suggest a strong involvement of genes predicted to be orthologs of other known regulators like Stk12 and McmA/1. Thus, more than 20 targets for future overexpression or deletion experiments were identified within this work.
Der thermophile, filamentöse Pilz Thermothelomyces thermophilus ist ein sehr effizienter natürlicher Produzent von Hydrolasen, wie z.B. lignocellulolytischen Enzymen. Um die Produktion von Hydrolasen und heterologen Proteinen weiter zu optimieren, ist das Verstehen der Expression und Regulation von Hydrolasen von großem Interesse. Dadurch kann die Expression von spezifischen Hydrolasen für Anwendungen in z.B. Bioraffinerien gesteigert, oder mit dem Ziel einer erhöhten Reinheit und Ausbeute von heterolog exprimierten Proteinen, verringert werden. Die Dissertation hatte deshalb zum Ziel: 1) molekularbiologische Methoden zu etablieren und anzuwenden, um Regulatoren der Cellulaseexpression zu deletieren, 2) Bioreaktorkultivierungen zu etablieren, mit den erstellten Stämmen durchzuführen und anschließend biochemisch zu analysieren und 3) das Transkriptom im Hinblick auf Expression und Regulation von Hydrolasen zu analysieren. Molekularbiologische Methoden wurden etabliert und erfolgreich angewendet, um bekannte Regulatoren der Cellulaseexpression (Clr1, Clr2, Clr4 und Vib1) und einen potenziell neuen (Vib2) zu deletieren. Die Gene clr2 und vib2 wurden mittels Split Marker Methode deletiert und clr4 und vib1 durch das neu etablierte CRISPR/Cas12a System. Die Deletion von clr1 erforderte die gleichzeitige Nutzung der Split Marker Methode und des CRISPR/Cas12a Systems. Protokolle für Bioreaktorkultivierungen mit T. thermophilus (Batch und Chemostat) wurden erfolgreich etabliert und ermöglichen zukünftige Studien unter kontrollierten, industriell relevanten Bedingungen. Die Transkriptomanalyse zeigte eine starke Expression vorhergesagter lignocellulolytischer Enzyme, insbesondere von Cellulasen, Hemicellulasen, Pektinasen und Esterasen als Antwort auf Cellulose. Fast alle vorhergesagten LPMOs wurden ebenfalls stark exprimiert. Demnach ist T. thermophilus für die Anwendung in Bioraffinerien geeignet. Zusätzlich offenbarte die Transkriptomanalyse stark exprimierte vorhergesagte Proteasen und bisher unbekannte Regulatoren der Expression von lignocellulolytischen Enzymen, welche deletiert oder überexprimiert werden könnten, um T. thermophilus für industrielle Anwendungen zu optimieren. Des Weiteren konnte die Rolle von Orthologen zu bekannten Regulatoren des Abbaus von pflanzlicher Biomasse detailliert untersucht werden, wodurch die essenzielle Funktion von Clr1 und Clr2 für die Cellulaseexpression gezeigt werden konnte. Hierbei ist die Expression von clr2 und damit die komplette lignocellulolytische Antwort auf Cellulose abhängig von Clr1. Die vorliegenden Daten für Clr4, bekannt als Aktivator der Cellulaseexpression, weisen stattdessen auf eine reprimierende Funktion hin, da eine Deletion zu einer höheren Expression putativer lignocellulolytischer Enzyme und den zugehörigen Regulatoren (z.B. Clr2) als Antwort auf Cellulose führte. Weiterhin konnte die Funktion des potenziell neuen Regulators Vib2 untersucht werden, welcher für eine Repression der frühen lignocellulolytischen Antwort auf Cellulose sorgt. Die Deletionsmutante von vib1 zeigte Wachstumsdefekte auf vielen Kohlenstoffquellen (einschließlich Cellulose) auf festem Medium, wogegen Cellulose bei flüssiger Kultivierung erfolgreich genutzt werden konnte. Die Transkriptomanalyse dieser Mutante wurde innerhalb dieser Arbeit nicht durchgeführt. Letztlich suggerieren die Daten eine starke Beteiligung von Genen die als Orthologe von anderen bekannten Regulatoren, wie z.B. Stk12 und McmA/1, identifiziert wurden. Somit konnten über 20 Gene für zukünftige Überexpressions- und Deletionsexperimente innerhalb dieser Arbeit identifiziert werden.