Microbial degradation and transformation of the antibiotic sulfamethoxazole under aerobic and anaerobic conditions

dc.contributor.advisorAdrian, Lorenz
dc.contributor.authorOuyang, Wei-Ying
dc.contributor.grantorTechnische Universität Berlinen
dc.contributor.refereeAdrian, Lorenz
dc.contributor.refereeNeubauer, Peter
dc.contributor.refereeRichnow, Hans
dc.date.accepted2021-06-04
dc.date.accessioned2021-07-14T10:40:40Z
dc.date.available2021-07-14T10:40:40Z
dc.date.issued2021
dc.description.abstractAntibiotics discharged in the environment raise concerns in public health and ecological functions. The broad occurrence of antibiotic residues contributes to the development and propagation of antibiotic resistance genes, causing a significant reduction of antibiotics available for treatments of infectious disease. Sulfamethoxazole (SMX) is one of the most frequently detected antibiotics in the environment, especially enriched in manure, sludge, and farm-impacted soil. Microbial degradation is the major sink of SMX in both natural and engineered systems. Aerobic SMX-degraders have been enriched and isolated, whereas identification of in-situ degrading populations is still challenging. Besides, field studies revealed the contribution of anaerobic processes to SMX mitigation, while knowledge about the anaerobic SMX-transforming bacteria is limited and no pure strain was described until now. In addition, a robust assessment method is needed to evaluate attenuation of SMX in complex matrices. In this study, we aimed to identify in-situ aerobic SMX-degraders, characterize anaerobic SMX-transforming cultures, and develop assessment techniques to evaluate removal of SMX in the environment. We investigated aerobic SMX-degrading bacteria in soil microcosms by culture-independent DNA and protein stable isotope probing (SIP). 0.5% of the carbon from 13C6-labeled SMX amended to soil microcosms was transformed to 13CO2 demonstrating partial mineralization of the antibiotic. DNA-SIP revealed incorporation of 13C from 13C6-labeled SMX into Actinobacteria and among them into the families Intrasporangiaceae, Nocardioidaceae, and Gaiellaceae and the order Solirubrobacterales. Protein-SIP demonstrated that the incorporation of 13C from 13C6-labeled SMX into proteins of bacteria of the families Intrasporangiaceae, Nocardioidaceae, and the order Solirubrobacterales, which was consistent with the results of DNA-SIP. The 13C abundance of 60 to 80% in several taxonomically relevant proteins indicated that Intrasporangiaceae directly acquired carbon from 13C6-labeled SMX, acting as primary SMX-degraders in the soil. Furthermore, we examined how microbial anaerobic transformation contributes to removal of SMX. We enriched SMX-transforming mixed cultures from sediment of a constructed wetland and digester sludge from a wastewater treatment plant. Transformation of SMX was observed in both sulfate-reducing and methanogenic cultures, whereas nitrate-reducing cultures showed no SMX transformation. In sulfate-reducing cultures, up to 90% of an initial SMX concentration of 100-250 µM was removed within 6 weeks of incubation. Our results demonstrated that the transformation was microbially catalyzed. The transformation products in sulfate-reducing cultures were identified as reduced and isomerized forms of SMX’s isoxazole moiety. The transformation products did not spontaneously re-oxidize to SMX after oxygen exposure, and their antibacterial activity significantly decreased compared to SMX. Population analysis in subsequent transfers of the enrichment revealed a community shift towards the genus Desulfovibrio. We therefore tested a deposited strain of Desulfovibrio vulgaris Hildenborough for its capacity to transform SMX and observed the same transformation products at similar rates. We then investigated the physiology of the mixed SMX-transforming cultures, and found that the mixed cultures did not grow on SMX. Transformation of SMX by D. vulgaris Hildenborough was identified as a cometabolic process. Addition of electron donor can promote transformation of SMX by D. vulgaris Hildenborough. Intact-cell activity test revealed that anaerobic transformation of SMX was an enzymatic reduction process, and SMX did not induce expression of specific transformation related proteins. Besides, in the intact-cell activity test, exponential phase cells showed higher activity towards SMX transformation compared with stationary phase cells. Significant carbon and hydrogen isotope fractionations (ε_C= 5.8±0.7‰, ε_H= 33.8±9.2‰) during anaerobic transformation of SMX by D. vulgaris Hildenborough was revealed by compound specific isotope fractionation (CSIA). The ε_C (-5.8±0.7‰) is significantly different from the reported values for aerobic degradation (ε_C=-0.6±0.1) and chemical treatments (ε_C=-0.8~-4.8 for photolysis, ε_C=-0.8~-2.2 for oxidation). Mechanism of anaerobic transformation was proposed as reductive transformation, which is different from hydroxylation and oxidation reported for microbial aerobic degradation and chemical treatments (photolysis and oxidation), the fact further verifies the robustness of CSIA to differentiate reaction mechanisms. Good correlation was observed between change of carbon isotopes and change of hydrogen isotopes. The distinctive lambda value (Λ_bulk^(H/C)) achieved in our study for anaerobic transformation of SMX can be applied in field study to assess attenuation of SMX. In sum, our work revealed that Intrasporangiaceae as non-cultivable bacteria played key roles in aerobic degradation of SMX in pig-farm impacted soil, and sulfate-reducing bacteria especially D. vulgaris transformed and detoxified SMX under anaerobic conditions. Processes for removal of SMX can be differentiated by the robust CSIA method. This study extended the understanding of microbial degradation and transformation of SMX under aerobic and anaerobic conditions, providing suggestions for bioremediation and wastewater treatment.en
dc.description.abstractDie Einführung von Antibiotika in die Umwelt ist nicht nur für die öffentliche Gesundheit sondern auch für die Funktionen von Ökosystemen bedenklich. Deren breites Auftreten trägt zur Entwicklung und Verbreitung von Antibiotika-resistenten Genen bei und verringert die Verfügbarkeit von Antibiotika zur Behandlung von Infektionskrankheiten. Sulfamethoxazol (SMX) ist eines der am häufigsten detektierte Antibiotika in der Umwelt mit besonders hoher Anreicherung in Gülle, Schlamm und agrarwirtschaftlich-beeinflussten Böden. Mikrobielle Degradation ist hierbei die Hauptsenke für SMX in natürlichen wie auch technischen Systemen. Zwar wurden aerobe SMX-degradierende Mikroorganismen angereichert und isoliert, jedoch ist die Identifikation von in-situ degradierenden Populationen noch immer herausfordernd. Feldstudien haben den Beitrag von anaeroben Prozessen zur Entschärfung der SMX-Problematik aufgezeigt, jedoch ist das Wissen über anaerobe SMX-transformierende Mikroorganismen limitiert und noch keine Reinkultur beschrieben. Ein robustes Bewertungsverfahren ist nötig, um den SMX-Abbau in komplexer Matrix zu bewerten. In der vorliegenden Studie lag unsere Zielstellung darin, in-situ aerobe SMX-Degradierer zu identifizieren, anaerobe SMX-transformierende Kulturen zu charakterisieren und Bewertungsmethoden zu entwickeln, um die Entfernung von SMX aus der Umwelt zu beurteilen. Wir untersuchten aerobe SMX-degradierende Bakterien in Boden-Mikrokosmen durch Kultivierungs-unabhängige DNS und Protein Stabile-Isotopen-basierte Techniken. Partielle SMX-Mineralisation wurde durch die Kohlenstoff-Transformation von 13C6-gelabeltem SMX zu 13CO2 um 0.5% in Boden-Mikrokosmen demonstriert. Stabile-Isotopen-basierte Untersuchungen zeigten die Inkorporation von 13C aus 13C6-gelabeltem SMX in die DNS von Actinobacteria, darunter die Familien Intrasporangiaceae, Nocardioidaceae und Gaiellaceae sowie die Ordnung Solirubrobacterales. Protein stabile-Isotopen-basierte Techniken demonstrierten die Inkorporation von 13C6-gelabeltem SMX in bakterielle Proteine der Familien Intrasporangiaceae, Nocardioidaceae sowie die Ordnung Solirubrobacterales. Dies stimmt mit den Ergebnissen der DNS stabilen-Isotopen Untersuchung überein. Die Abundanz von 60-80% des 13C innerhalb einiger taxonomisch relevanter Proteine deutet auf die direkte Aufnahme von 13C-gelabeltem SMX durch Intrasporangiaceae und dessen dominante Beteiligung bei der SMX-Degradation im Boden hin. Zudem untersuchten wir, inwiefern anaerobe Transformation zur Entfernung von SMX beiträgt. Hierbei wurden SMX-transformierende Mischkulturen aus Sediment eines technischen Feuchtgebietes und Faulschlamm einer Kläranlage angereichert. Die SMX-Transformation wurde bei Sulfat-reduzierenden sowie methanogenen, jedoch nicht Nitrat-reduzierenden Kulturen beobachtet. In Sulfat-reduzierenden Kulturen wurden bei einer Initialkonzentration von 100-250 µM SMX bis zu 90% SMX innerhalb von 6 Wochen Inkubation entfernt. Unsere Resultate demonstrierten, dass es sich um eine mikrobiell-katalysierte Transformation handelte. Die Transformationsprodukte unter Sulfat-reduzierenden Bedingungen wurden als reduzierte und isomerisierte Form der SMX Isoxazol-Funktionalität identifiziert und beschrieben. Sie unterlagen bei Sauerstoff-Exposition keiner spontanen Re-Oxidation und ihre antibakterielle Aktivität verringerte sich signifikant im Vergleich zu SMX. Populationsanalysen bei anschließender Übertragung der Anreicherungskulturen zeigten eine Verschiebung der mikrobiellen Gemeinschaft zu der Gattung Desulfovibrio. Folglich testeten wir einen hinterlegten Stamm von Desulfovibrio vulgaris Hildenborough bzgl. dessen Kapazität SMX zu transformieren und beobachteten bei gleiche Rate die selben Transformationsprodukte. Des Weiteren untersuchten wir die Physiologie der SMX-transformierenden Mischkulturen und zeigten, dass diese nicht auf Basis von SMX wuchsen. Die Transformation von SMX durch Desulfovibrio vulgaris Hildenborough wurde als cometabolischer Prozess identifiziert und die Zugabe von Elektronendonor kann die Transformation von SMX durch D. vulgaris verstärken. Aktivitäts-Tests mit intakten Zellen zeigten auf, dass die anaerobe Transformation von SMX ein enzymatischer Reduktionsprozess ist und keine Expression spezifischer Transformations-bezogener Proteine induziert wurde. Innerhalb von Aktivitäts-Test mit intakten Zellen wiesen diese in exponentieller Wachstumsphase höhere Aktivität bzgl. SMX-Transformation im Vergleich zu Zellen in stationärer Phase auf. Signifikante Kohlenstoff- und Wasserstoff-Isotopenfraktionierung (ε_C= 5.8±0.7‰, ε_H= 33.8±9.2‰) wurde während der anaeroben SMX-Transformation durch D. vulgaris Hildenborough durch Komponenten-spezifische Isotopen-Fraktionierung (CSIA) aufgedeckt. Der ε_C (-5.8±0.7‰) unterschied sich signifikant im Vergleich zu beschriebenen Werten für die aerobe Degradation (ε_C=-0.6±0.1) und chemische Behandlung (ε_C=-0.8~-4.8 für Photolyse, ε_C=-0.8~-2.2 für Oxidation). Der Mechanismus der anaeroben Transformation wird als reduktive Transformation vorgeschlagen, was sich deutlich von der beschriebenen Hydroxylierung und Oxidation für mikrobielle aerobe Degradation und chemische Behandlung (Photolyse, Oxidation) unterscheidet. Dies bestätigt die Robustheit von CSIA zur Differenzierung von Reaktionsmechanismen. Eine gute Korrelation konnte zwischen Kohlenstoff- und Wasserstoff-Isotopen beobachtet werden. Die in dieser Studie der anaeroben Transformation von SMX erhaltenen sich unterscheidenden Lambda-Werte (Λ_bulk^(H/C)), können in Feldstudien angewendet werde, um den Abbau von SMX festzustellen. Zusammengefasst deckte unsere Arbeit auf, dass Intrasporangiaceae als nicht-kultivierbare Bakterien eine Schlüsselrolle während der aeroben Degradation von SMX in Schweinezucht-beeinflusstem Boden spielten sowie Sulfat-reduzierende Bakterien, insbesondere D. vulgaris Hildenborough, unter anaeroben Bedingungen SMX transformierten und detoxifizierten. Prozesse zur Entfernung von SMX können durch die robuste CSIA-Methode differenziert werden. Diese Studie erweiterte das Verständnis für mikrobielle Transformation von SMX unter aeroben und anaeroben Bedingungen und stellt Vorschläge für Bioremediation und Abwasserbehandlung zur Verfügung.de
dc.identifier.urihttps://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/13234
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.14279/depositonce-12029
dc.language.isoenen
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/en
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften; Biologiede
dc.subject.ddc579 Mikroorganismen, Pilze, Algende
dc.subject.othersulfamethoxazoleen
dc.subject.othermicrobial degradationen
dc.subject.otherstable isotope probingen
dc.subject.othersulfate reducing bacteriaen
dc.subject.otherstable isotope fractionationen
dc.subject.otherSulfamethoxazolde
dc.subject.othermikrobieller Abbaude
dc.subject.otherstabile Isotopensondierungde
dc.subject.otheraulfatreduzierende Bakteriende
dc.subject.otherstabile Isotopenfraktionierungde
dc.titleMicrobial degradation and transformation of the antibiotic sulfamethoxazole under aerobic and anaerobic conditionsen
dc.title.translatedMikrobieller Abbau und Umwandlung des Antibiotikums Sulfamethoxazol unter aeroben und anaeroben Bedingungende
dc.typeDoctoral Thesisen
dc.type.versionacceptedVersionen
tub.accessrights.dnbfreeen
tub.affiliationFak. 3 Prozesswissenschaften>Inst. Biotechnologiede
tub.affiliation.facultyFak. 3 Prozesswissenschaftende
tub.affiliation.instituteInst. Biotechnologiede
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