Structural investigation of the photocycle of the bacterial bathy phytochrome Agp2 PAiRFP2
| dc.contributor.advisor | Scheerer, Patrick | |
| dc.contributor.author | Herder, Luisa Marie Sabine | |
| dc.contributor.grantor | Technische Universität Berlin | en |
| dc.contributor.referee | Scheerer, Patrick | |
| dc.contributor.referee | Hildebrandt, Peter | |
| dc.contributor.referee | Forest, Katrina | |
| dc.date.accepted | 2021-12-01 | |
| dc.date.accessioned | 2022-04-25T08:22:37Z | |
| dc.date.available | 2022-04-25T08:22:37Z | |
| dc.date.issued | 2022 | |
| dc.description.abstract | Light act as an indispensable source for organisms to receive environmental information for essential physiological processes. One of the most essential photoreceptors for sensing light is the phytochrome. It converts light information into biological signals and regulates, for example, photosynthesis or motility in plants, bacteria, and fungi. Phytochromes harbor a linear bilin-type tetrapyrrole chromophore covalently attached to a cysteine within the chromophore binding domain. They absorb red or far-red light to start a reversible photocycle from the parent states Pr to Pfr or vice versa. After photon absorption, early (Lumi) and late (Meta) intermediate states are passed through before the second parent state is reached. This process starts with the light-triggered photoisomerization of the chromophore (Lumi), followed by chromophore relaxations and structural rearrangements in the chromophore binding pocket (Meta). The decay of the Meta states to the final photoconversion products is coupled with crucial protein structural changes of the secondary and/or tertiary structure, which activates the downstream signal transduction pathways. The entire process is not yet fully understood as structural data on the mechanistic details at the molecular level are not available. In this dissertation, the first crystal structure of a late intermediate Meta-F state of the fluorescence-optimized mutant PAiRFP2 from the soil bacterium Agrobacterium fabrum (Agp2) was obtained using protein X-ray crystallography at a conventional synchrotron (XRD). This crystal structure shows changes directly at the chromophore (isomerization of ZZEssa into a ZZZssa configuration) and numerous rearrangements of amino acids in the chromophore pocket. In addition, long-range effects such as the onset of secondary structure transition of the PHY tongue become visible. These data allow a first structural model for the sequence of the photoactivation cycle. However, to obtain a complete overall view of the changes around the chromophore, the sequence of events and long-range effects of signal propagation, more detailed insights at a structural level were still required. Due to synchrotron limitations, it was not possible to capture the very fast light-induced transformations that lead to different intermediate states of phytochromes. Therefore, the high-end method of serial femtosecond X-ray crystallography (SFX) at free-electron laser facilities was used in order to follow the ultrafast light-triggered structural changes in proteins with a time-resolved approach. In this thesis, nine SFX data sets were acquired with different light exposure times (pump-probe) on phytochrome crystals. These pump-probe experiments led to time-resolved crystallographic snapshots that confirm the structural activation model of the sequence predicted from XRD data and reveal more details as well as novel insights into changes occurring before and after the Meta-F intermediate substate. After photon absorption, the first two intermediate states, i(30ms) and i(60ms), represent the chromophore isomerization and first relaxation processes of the chromophore. From the third intermediate state i(100ms) onwards, the amino acids of the chromophore binding pocket become visibly involved. The following intermediate states i(140ms) and i(170ms) reveal additional amino acids involved in the photoconversion process and a proceeding chromophore relaxation. Additionally, the two late intermediate states with the longest illumination and relaxation time, i(3s) and i(6s), show long-range transitions, affecting the secondary structure of the protein for the first time. The successful light-triggered experiments on crystals of the bacterial bathy phytochrome PAiRFP2 of Agp2 presented here using both synchrotron radiation and free-electron laser facilities serve as a model for the activation process for phytochromes. These data show the molecular sequence of activation events as in a molecular movie from the dark-adapted Pfr state through the light-triggered transition to the final photoproduct of PAiRFP2. | en |
| dc.description.abstract | Licht ist die essenzielle Quelle für Organismen, um Umweltinformationen für lebensnotwendige physiologische Prozesse zu erhalten. Einer der wichtigsten Photorezeptoren zur Lichtwahrnehmung ist das Phytochrom. Es wandelt Lichtinformationen in biologische Signale um und reguliert dadurch beispielsweise die Photosynthese oder die Motilität in Pflanzen, Bakterien und Pilzen. Phytochrome besitzen ein lineares, bilinartiges Tetrapyrrol als Chromophor, der kovalent an ein Cystein innerhalb der Chromophor-Bindungsdomäne gebunden ist. Sie absorbieren rotes oder fernrotes Licht, um einen reversiblen Photozyklus von den Grundzuständen Pr zu Pfr bzw. umgekehrt zu starten. Nach der Photonenabsorption werden frühe (Lumi) und späte (Meta) Zwischenzustände durchlaufen, bevor der zweite Grundzustand erreicht wird. Dieser Prozess beginnt mit der lichtinduzierten Photoisomerisierung des Chromophors (Lumi), gefolgt von Relaxationsprozessen des Chromophors und strukturellen Umlagerungen innerhalb der Chromophor-Bindungstasche (Meta). Der Übergang der Meta-Zustände zu den finalen Photokonversionsprodukten ist mit entscheidenden strukturellen Änderungen der Sekundär- und/oder Tertiärstruktur des Proteins gekoppelt, wodurch die nachgeschalteten Signaltransduktionswege aktiviert werden. Der gesamte Prozess ist noch nicht vollständig verstanden, da strukturelle Daten der mechanistischen Details auf molekularer Ebene nicht zur Verfügung stehen. In dieser Dissertation wurde die erste Kristallstruktur eines späten intermediären Meta-F Zustands der fluoreszenzoptimierten Mutante PAiRFP2 aus dem Bodenbakterium Agrobacterium fabrum (Agp2) mittels Proteinkristallographie an einem konventionellen Synchrotron (XRD) aufgeklärt. Diese Kristallstruktur zeigt Veränderungen direkt am Chromophor (Isomerisierung von der ZZEssa- in die ZZZssa-Konfiguration) und zahlreiche Umlagerungen von Aminosäuren in der Chromophortasche. Außerdem werden weitreichende Auswirkungen wie der Beginn des Sekundärstrukturübergangs der PHY-Zunge sichtbar. Um jedoch einen vollständigen Einblick in die Veränderungen um den Chromophor, die Abfolge der Prozesse und die weitreichenden Effekte der Signalausbreitung zu erhalten, sind noch detailliertere Informationen auf struktureller Ebene erforderlich. Aufgrund der Limitierungen des Synchrotrons war es nicht möglich, die sehr schnellen lichtgesteuerten Umwandlungen zu erfassen, die zu verschiedenen Zwischenzuständen von Phytochromen führen. Daher erwies sich die High-End-Methode der seriellen Femtosekunden-Röntgenkristallographie (SFX) an Freie-Elektronen-Laser-Anlagen als geeignet, um die ultraschnellen lichtinduzierten Strukturänderungen in Proteinen zeitaufgelöst zu verfolgen. In dieser Dissertation wurden somit neun SFX-Datensätze mit unterschiedlichen Belichtungszeiten (Pump-Probe) an Phytochrom-Kristallen aufgenommen. Diese Pump-Probe-Experimente führten zu zeitaufgelösten, kristallographischen Momentaufnahmen, die die Sequenz des aus den XRD-Daten vorgeschlagenen Aktivierungsmodells bestätigen, aber auch weitere Informationen vor und nach dem Meta-F Zwischenzustand offenbaren. Nach der Photonenabsorption veranschaulichen die ersten beiden Zwischenzustände i(30ms) und i(60ms) die Isomerisierung und erste Relaxationsprozesse des Chromophors. Ab dem dritten Zwischenzustand i(100ms) sind auch Aminosäuren der Chromophor-Bindungstasche sichtbar beteiligt. Die folgenden Zwischenzustände i(140ms) und i(170ms) zeigen weitere am Photokonversionsprozess beteiligte Aminosäuren sowie eine fortschreitende Relaxation des Chromophors. Zusätzlich enthüllen die beiden Zwischenzustände mit der längsten Belichtungs- und Relaxationszeit, i(3s) und i(6s), erstmals weitreichende Übergänge, die die Sekundärstruktur des Proteins beeinflussen. Die hier vorgestellten, erfolgreichen lichtgesteuerten Experimente an Kristallen des bakteriellen Bathyphytochroms PAiRFP2 von Agp2, bei denen sowohl Synchrotron- als auch Freie-Elektronen-Laser-Anlagen verwendet wurden, dienen als Modell für den Aktivierungsprozess von Phytochromen. Diese Daten zeigen die molekulare Abfolge des Aktivierungsprozesses vom dunkeladaptierten Pfr-Zustand über die lichtinduzierte Umlagerung zum finalem Photoprodukt von PAiRFP2 wie in einem molekularen Film. | de |
| dc.description.sponsorship | DFG, 221545957, Protonen-gekoppelte Konformationsänderungen in Photorezeptoren (B06) | en |
| dc.identifier.uri | https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/16346 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-15121 | |
| dc.language.iso | en | en |
| dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ | en |
| dc.subject.ddc | 548 Kristallografie | de |
| dc.subject.ddc | 541 Physikalische Chemie | de |
| dc.subject.ddc | 572 Biochemie | de |
| dc.subject.other | phytochrome | en |
| dc.subject.other | X-ray crystallography | en |
| dc.subject.other | free-electron laser | en |
| dc.subject.other | time-resolved SFX | en |
| dc.subject.other | intermediate state | en |
| dc.subject.other | Phytochrom | de |
| dc.subject.other | Röntgenstrukturanalyse | de |
| dc.subject.other | Freie-Elektronen-Laser | de |
| dc.subject.other | Zeitaufgelöste SFX | de |
| dc.subject.other | Zwischenzustand | de |
| dc.title | Structural investigation of the photocycle of the bacterial bathy phytochrome Agp2 PAiRFP2 | en |
| dc.title.translated | Strukturelle Untersuchung des Photozyklus des bakteriellen Bathy-Phytochroms Agp2 PAiRFP2 | de |
| dc.type | Doctoral Thesis | en |
| dc.type.version | acceptedVersion | en |
| tub.accessrights.dnb | free | en |
| tub.affiliation | Fak. 2 Mathematik und Naturwissenschaften::Inst. Chemie::FG Physikalische Chemie / Biophysikalische Chemie | de |
| tub.affiliation.faculty | Fak. 2 Mathematik und Naturwissenschaften | de |
| tub.affiliation.group | FG Physikalische Chemie / Biophysikalische Chemie | de |
| tub.affiliation.institute | Inst. Chemie | de |
| tub.publisher.universityorinstitution | Technische Universität Berlin | en |