Interaction of proteins with multivalent polyelectrolytes
| dc.contributor.advisor | Ballauff, Matthias | |
| dc.contributor.advisor | Gradzielski, Michael | |
| dc.contributor.author | Walkowiak, Jacek | |
| dc.contributor.grantor | Technische Universität Berlin | en |
| dc.contributor.referee | Ballauff, Matthias | |
| dc.contributor.referee | Gradzielski, Michael | |
| dc.contributor.referee | Böker, Alexander | |
| dc.date.accepted | 2020-09-09 | |
| dc.date.accessioned | 2020-10-09T14:05:12Z | |
| dc.date.available | 2020-10-09T14:05:12Z | |
| dc.date.issued | 2020 | |
| dc.description.abstract | In the present work the thermodynamics of protein adsorption to charged polyelectrolytes is explored. Unravelling interactions of proteins with highly charged polyelectrolytes as e.g. DNA is a central topic in biophysics since many years. It is now well-established that ionic interactions play a major role for the strength of binding as expressed through the thermodynamic binding constant Kb. Moreover, counterion release has been identified as the driving force for binding: Patches of positively charged amino acid residues located on the surface of the protein act as multivalent counterions that compensate the charge of the polyelectrolyte. In this way a concomitant number of counterions condensed to the polyelectrolyte are released. The first part of this thesis contributes to the understanding of counterion condensation that determines the effective charge of a polyelectrolyte. The interaction between dendritic polyglycerol sulfate (dPGS) and divalent ions (Mg2+ and Ca2+) were analyzed by combination of experiment (isothermal titration calorimetry (ITC)) and theory (non-linear penetrable Poisson-Boltzmann (PPB) model). The discussed lack of ion-specific effects upon adsorption of divalent ions to dPGS and a clear competition between mono- and divalent ions allows a better understanding of the fundamentals of polyelectrolyte-protein (PE-P) interaction that are presented in the following chapters. In the second part, a comprehensive thermodynamic study of the PE-P interaction is presented. Starting form a linear (heparin) and low molecular weight (β cyclodextrin sulfate (β-CD-S)) polyelectrolytes up to a polyelectrolyte brushes - a detailed picture of the binding driving forces is given. A quantitative analysis of the thermodynamic processes involved in the interaction of the model glycosaminoglycan (GAG) - heparin and lysozyme is presented. The binding constant Kb was determined by ITC as the function of temperature and ionic strength adjusted through the concentration cs of added salt. The dependence on salt concentration cs was used to determine the net number of released counterions. Moreover, the binding constant at a reference salt concentration of 1M Kb(1M) was determined by extrapolation. The dependence on temperature of Kb was used to dissect the binding free energy ΔGb into the respective enthalpies ΔHb and entropies ΔSb together with the specific heat capacity change ΔCp. A strong enthalpy-entropy cancellation (EEC) was found similar to the results for many other systems. The binding free energy ΔGb could furthermore be split up into a part ΔGci due to counterion release and a residual part ΔGres. The latter quantity reflects specific contributions as e.g. salt bridges, van der Waals interactions or hydrogen bonds. The entire analysis shows that heparin-lysozyme interactions are mainly caused by counterion release, that is, ca. three counterions are being released upon binding of one lysozyme molecule. The presented approach was then applied in studies of β-CD-S - lysozyme binding. In that case also, three counterions released during the adsorption are the main driving force of the analyzed process. The reported approach of quantifying interactions between GAGs and CDs with proteins is in general applicable and suitable to provide new insights in the physical modulation of biomolecular signals. Subsequently, the analysis of the PE-P interaction is extend in order to obtain the full thermodynamic information on the binding of protein to polyelectrolyte brushes. Thus, a thermodynamic study of the adsorption of human serum albumin (HSA) onto spherical polyelectrolyte brushes (SPB) is presented. The SPBs are composed of a solid polystyrene core bearing long chains of poly(acrylic acid) (PAA). ITC measurements done at different temperatures and ionic strengths lead to a full set of thermodynamic binding constants together with the enthalpies and entropies of binding. The adsorption of HSA onto SPBs is described with a two-step model with a binding constant Kb on the order of 105 and 104 M-1 for the first and second binding step, respectively. The free energy of binding ∆Gb depends only weakly on temperature because of a marked compensation of enthalpy by entropy. Studies of the adsorbed HSA by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) demonstrates no significant disturbance in the secondary structure of the protein. The quantitative analysis demonstrates that counterion release is the major driving force for adsorption. A comparison with the analysis of previously discussed systems demonstrates that EEC is a general phenomenon dominated by released counterion that always accompanies the binding of proteins to polyelectrolytes. The last part of this thesis presents a quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D) study of HSA adsorption onto a planar polyelectrolyte brush (PPB). This allows a quantitative comparison with calorimetric studies of HSA-SPB interaction. For this, the preparation of a PAA brush, polymerized by atom transfer radical polymerization (ATRP) of tert-butyl acrylate (tBA) and subsequent acid hydrolysis, on the flat gold surfaces of QCM crystals is presented. The PAA brush was characterized by FT-IR spectroscopy, ellipsometry and water contact angle analysis. The interaction of the brush with HSA was studied for a range of ionic strengths and pH conditions. The quantitative analysis showed a strong adsorption of protein molecules onto the brush. By increasing the ionic strength a fraction of the initially adsorbed HSA was released. A comparison with recent calorimetric studies related to the binding of HSA to polyelectrolytes allowed to analyze the QCM data based on the results of the thermodynamic analysis of the PE-P binding process. | en |
| dc.description.abstract | In der vorliegenden Arbeit wird die Thermodynamik der Proteinadsorption an geladenen Polyelektrolyten untersucht. Die Untersuchung von Wechselwirkungen von Proteinen mit hoch geladenen Polyelektrolyten, wie z. DNA ist seit vielen Jahren ein zentrales Thema in der Biophysik. Es ist mittlerweile bekannt, dass ionische Wechselwirkungen eine wichtige Rolle für die Bindungsstärke spielen, die durch die thermodynamische Bindungskonstante Kb ausgedrückt wird. Darüber hinaus wurde die Freisetzung von Gegenionen als treibende Kraft für die Bindung identifiziert: Positiv geladene Aminosäurereste auf der Oberfläche des Proteins wirken als multivalente Gegenionen, die die Ladung des Polyelektrolyten kompensieren. Auf diese Weise wird eine Anzahl von am Polyelektrolyten kondensierten Gegenionen freigesetzt. Der erste Teil dieser Arbeit trägt zum Verständnis der Gegenionenkondensation bei, die die effektive Ladung eines Polyelektrolyten bestimmt. Die Wechselwirkung zwischen dendritischem Polyglycerinsulfat (dPGS) und zweiwertigen Ionen (Mg2+ und Ca2+) wurde durch Kombination von Experiment (isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)) und Theorie (nonlinear penetrable Poisson-Boltzmann (PPB) -Modell) analysiert. Das Fehlen ionenspezifischer Effekte auf die Adsorption zweiwertiger Ionen an dPGS und eine klare Konkurrenz zwischen ein- und zweiwertigen Ionen ermöglichen ein besseres Verständnis der Grundlagen der Wechselwirkung zwischen Polyelektrolyt und Protein (PE-P), die in den folgenden Kapiteln vorgestellt werden. Im zweiten Teil wird eine umfassende thermodynamische Untersuchung der PE-P-Wechselwirkung vorgestellt. Ausgehend von linearen (Heparin) und niedermolekularen (β-Cyclodextrinsulfat (β-CD-S)) Polyelektrolyten bis hin zu Polyelektrolytbürsten wird ein detailliertes Bild der Bindungsantriebskräfte gegeben. Eine quantitative Analyse der thermodynamischen Prozesse, die an der Wechselwirkung des Modells Glycosaminoglycan (GAG) - Heparin und Lysozym beteiligt sind, wird vorgestellt. Die Bindungskonstante Kb wurde durch ITC als Funktion der Temperatur und der Ionenstärke bestimmt, die durch die Konzentration cs des zugesetzten Salzes eingestellt wurden. Die Abhängigkeit von der Salzkonzentration cs wurde verwendet, um die Nettozahl der freigesetzten Gegenionen zu bestimmen. Darüber hinaus wurde die Bindungskonstante bei einer Referenzsalzkonzentration von 1 M Kb(1 M) durch Extrapolation bestimmt. Die Abhängigkeit von Kb von der Temperatur wurde verwendet, um die freie Bindungsenergie ΔGb in die jeweiligen Enthalpien ΔHb und Entropien ΔSb zusammen mit der spezifischen Wärmekapazitätsänderung ΔCp zu zerlegen. Eine starke Enthalpie-Entropie-Aufhebung (EEC) wurde ähnlich wie bei vielen anderen Systemen gefunden. Die freie Bindungsenergie ΔGb konnte aufgrund der Freisetzung von Gegenionen und eines Restteils ΔGres in einen Teil ΔGci aufgeteilt werden. Die letztere Größe spiegelt spezifische Beiträge wie z. Salzbrücken, Van-der-Waals-Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrücken wider. Die gesamte Analyse zeigt, dass Heparin-Lysozym-Wechselwirkungen hauptsächlich durch die Freisetzung von Gegenionen verursacht werden. Bei der Bindung eines Lysozymmoleküls werden drei Gegenionen freigesetzt. Der vorgestellte Ansatz wurde dann in Studien zur Bindung von β-CD-S - Lysozym angewendet. Auch in diesem Fall sind drei während der Adsorption freigesetzte Gegenionen die Hauptantriebskraft des analysierten Prozesses. Der beschriebene Ansatz zur Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen GAGs und CDs mit Proteinen ist allgemein anwendbar und geeignet, um neue Erkenntnisse über die physikalische Modulation biomolekularer Signale zu gewinnen. Anschließend wird die Analyse der PE-P-Wechselwirkung erweitert, um die vollständigen thermodynamischen Informationen über die Bindung von Protein an Polyelektrolytbürsten zu erhalten. Daher wird eine thermodynamische Untersuchung der Adsorption von Humanserumalbumin (HSA) an kugelförmigen Polyelektrolytbürsten (SPB) vorgestellt. Die SPBs bestehen aus einem festen Polystyrolkern, der lange Ketten aus Poly(acrylsäure) (PAA) trägt. ITC-Messungen, die bei unterschiedlichen Temperaturen und Ionenstärken durchgeführt werden, führen zu einem vollständigen Satz thermodynamischer Bindungskonstanten, zusammen mit den Enthalpien und Entropien der Bindung. Die Adsorption von HSA an SPBs wird mit einem zweistufigen Modell mit einer Bindungskonstante Kb in der Größenordnung von 105 und 104 M-1 für den ersten bzw. zweiten Bindungsschritt beschrieben. Die freie Bindungsenergie ∆Gb hängt aufgrund einer deutlichen Kompensation der Enthalpie durch Entropie nur schwach von der Temperatur ab. Untersuchungen der adsorbierten HSA durch Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) zeigen keine signifikante Störung der Sekundärstruktur des Proteins. Die quantitative Analyse zeigt, dass die Freisetzung von Gegenionen die Hauptantriebskraft für die Adsorption ist. Ein Vergleich mit der Analyse zuvor diskutierter Systeme zeigt, dass die EEC ein allgemeines Phänomen ist, das von der Freisetzung von Gegenionen dominiert wird und immer mit der Bindung von Proteinen an Polyelektrolyte einhergeht. Der letzte Teil dieser Arbeit präsentiert eine Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipation (QCM-D) zur HSA-Adsorption auf einer planaren Polyelektrolytbürste (PPB). Dies ermöglicht einen quantitativen Vergleich mit kalorimetrischen Studien der HSA-SPB-Wechselwirkung. Hierzu wird die Herstellung einer PAA-Bürste vorgestellt, die durch Atomtransfer-Radikalpolymerisation (ATRP) von tert-Butylacrylat (tBA) und anschließende Säurehydrolyse auf den flachen Goldoberflächen von QCM-Kristallen polymerisiert wird. Die PAA-Bürste wurde durch FT-IR-Spektroskopie, Ellipsometrie und Wasserkontaktwinkelanalyse charakterisiert. Die Wechselwirkung der Bürste mit HSA wurde für eine Reihe von Ionenstärken und pH-Bedingungen untersucht. Die quantitative Analyse zeigte eine starke Adsorption von Proteinmolekülen an der Bürste. Durch Erhöhen der Ionenstärke wurde ein Teil des anfänglich adsorbierten HSA freigesetzt. Ein Vergleich mit kürzlich durchgeführten kalorimetrischen Studien zur Bindung von HSA an Polyelektrolyte ermöglichte die Analyse der QCM-Daten auf der Grundlage der Ergebnisse der thermodynamischen Analyse des PE-P-Bindungsprozesses. | de |
| dc.description.sponsorship | DFG, GRK 1524, Self-Assembled Soft-Matter Nanostructures at Interfaces | en |
| dc.description.sponsorship | DFG, SFB 765, Multivalency in Chemistry and Biology | en |
| dc.description.sponsorship | DFG, SFB 1349, Fluor-Specific Interactions: Fundamentals and Functions | en |
| dc.identifier.uri | https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/11686 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-10574 | |
| dc.language.iso | en | en |
| dc.rights.uri | https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | en |
| dc.subject.ddc | 541 Physikalische Chemie | de |
| dc.subject.other | polyelectrolytes | en |
| dc.subject.other | protein | en |
| dc.subject.other | thermodynamic | en |
| dc.subject.other | counterion release | en |
| dc.subject.other | enthalpy-entropy cancellation | en |
| dc.subject.other | Polyelektrolyt | de |
| dc.subject.other | Protein | de |
| dc.subject.other | thermodynamisch | de |
| dc.subject.other | Gegenionenfreisetzung | de |
| dc.subject.other | Enthalpie-Entropie-Aufhebung | de |
| dc.title | Interaction of proteins with multivalent polyelectrolytes | en |
| dc.title.translated | Wechselwirkung von Proteinen mit mehrwertigen Polyelektrolyten | de |
| dc.type | Doctoral Thesis | en |
| dc.type.version | acceptedVersion | en |
| tub.accessrights.dnb | free | en |
| tub.affiliation | Fak. 2 Mathematik und Naturwissenschaften::Inst. Chemie::FG Physikalische Chemie / Molekulare Materialwissenschaften | de |
| tub.affiliation.faculty | Fak. 2 Mathematik und Naturwissenschaften | de |
| tub.affiliation.group | FG Physikalische Chemie / Molekulare Materialwissenschaften | de |
| tub.affiliation.institute | Inst. Chemie | de |
| tub.publisher.universityorinstitution | Technische Universität Berlin | en |