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Pressure and temperature effects on the enzymatic conversion of biopolymers

Buckow, Roman

Untersucht wurde der Einfluss von hydrostatischem Hochdruck und Temperatur auf den Abbau von Maisstärkekörnern sowie die Stabilität und katalytische Aktivität von α- und β-Amylase aus Gerstenmalz, β-Glucanase aus Gerstenmalz und Bacillus subtilis als auch Glucoamylase aus Aspergillus niger. Kinetische Untersuchungen zur Enzymdeaktivierung wurden bei verschiedenen Druck-Temperatur-Kombinationen im Bereich 30-95°C und Drücken bis zu 1400 MPa in verschiedenen Modellsystemen durchgeführt. Innerhalb des untersuchten Druck-Temperatur Bereichs zeigten die Deaktivierungskinetiken der untersuchten Enzyme unter isobaren und isothermen Bedingungen eine Abweichung zur einfachen Reaktion erster Ordnung und wurden daher mit einem Reaktionsmodel n-ter Ordnung beschrieben. Die Analyse der Deaktivierungskurven im untersuchten Temperatur- und Druckbereich mittels verschiedener kinetischer Modelle ergab, dass eine Beschreibung der gefundenen Kurven am besten mit der Reaktionsordnung n = 1,4 (β-Amylase), 1,6 (β-Glucanase aus Gerstenmalz), 1,8 (β-Glucanase aus B.subtilis) und 2,1 (α-Amylase) beschrieben erfolgen konnte. Nach Festlegung der Reaktionsordnung konnte nun die Geschwindigkeitskonstante der Deaktivierung k als alleiniger druck- und temperaturabhängiger Parameter ermittelt werden. Die Deaktivierungskurven von Glucoamylase zeigten einen klaren biphasischen Verlauf, was mit der Existenz zweier Enzymisoformen erklärt werden konnte. Die Kinetiken erster Ordnung wurden daher mit einem Zwei-Fraktions-Modell beschrieben. Schließlich konnten die gefundenen Abhängigkeiten der Deaktivierungsgeschwindigkeitskonstanten von Druck und Temperatur erfolgreich mit einem thermodynamisch basierten Polynom-Modell beschrieben werden. Diese mathematischen Modelle wurden anschließend dafür benutzt, um den gefundenen enzymatischen Substratumsatz von der eventuell überlagerten Enzymdeaktivierung zu befreien. Diese Prozedur erlaubt nun die isolierte Betrachtung des Einflusses von Druck und Temperatur auf den Substratumsatz. β-Glucanase aus B.subtilis zeigte eine deutlich erhöhte katalytische Aktivität bei erhöhtem Druck und Temperatur. Alle anderen Enzyme zeigten eine reduzierte katalytische Aktivität bei erhöhtem Druck, aber eine stark erhöhte Aktivität mit einer Erhöhung der Temperatur. Für die Gesamtreaktion des Substratumsatzes mit gleichzeitig stattfindender Enzymdeaktivierung konnten spezifische Druck-Temperatur-Zeit-Kombinationen ermittelt werden, die ein Maximum an Substratumsatz liefern. Die jeweiligen Optima lagen dabei bei 165 MPa und 66°C (α-Amylase), 106 MPa und 60°C (β-Amylase), 220 MPa und 55°C (β-Glucanase aus Gerstenmalz), 270 MPa und 80°C (Glucoamylase in Anwesenheit von Maisstärke), 307 MPa und 63°C (β-Glucanase aus B.subtilis) und 318 MPa und 84°C (Glucoamylase in Anwesenheit von Maltosemonohydrat) nach einer Prozesszeit von 30 Minuten. Im Vergleich zum maximalen Substratumsatz bei Umgebungsdruck konnte bei optimalen Druck-Temperatur-Bedingungen etwa 20% (β-Amylase) bis zu 400% (β-Glucanase aus B.subtilis) mehr Substrat umgesetzt werde. Der Verlust der Doppelbrechung von polarisiertem Licht wurde als Indikator zur Beschreibung irreversibler Quellungs- und Verkleisterungsvorgänge in Maisstärkekörnern verwendet. Stärkequellung wurde in einem Druckbereich von 0.1-650 MPa und Temperatur von 30-75°C bestimmt. Die Quellung der Stärkekörner verlief mit einer Reaktionsordung von 1,65 sowohl unter Umgebungsdruck als auch unter Hochdruckbedingungen. Die Geschwindigkeitskonstante konnte anschießend als Funktion von Druck und Temperatur mit einem sigmoidalen Modell beschrieben werden, wobei die Schmelztemperatur der Stärkekörner als Referenzpunkt benutzt wurde. Es zeigte sich, dass die Geschwindigkeit der Stärkeverkleisterung ausschließlich abhängig von der Temperatur war, solange der Druck 300 MPa nicht überstieg. Bei höheren Drücken verlagerte sich der Punkt der Stärkeverkleisterung hin zu niedrigen Temperaturen. Bei 30°C wurde eine komplette Verkleisterung der Maisstärke nach einer Behandlung bei 650 MPa für 30 Minuten festgestellt. Abschließend konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu optimalen Bedingungen bei Umgebungsdruck die Verzuckerung von nativer Maisstärke durch Glucoamylase durch eine Druck- und Temperaturerhöhung um das 2,5 fache beschleunigt werden kann. Ebenfalls konnte bewiesen werden, dass die enzymatische Verzuckerung von Gerstenmalz durch eine Druckbeaufschlagung bei gleichzeitiger Temperaturerhöhung beschleunigt und die Prozesszeit damit um ein Viertel reduziert werden kann.
The impact of high hydrostatic pressure and temperature on the gelatinization of maize starch granules and on the stability and catalytic activity of α- and β-amylase from barley malt, β-glucanase from barley malt and Bacillus subtilis as well as glucoamylase from Aspergillus niger was investigated. The thermal and combined pressure-temperature inactivation experiments were performed at temperatures of 30-95°C and pressures up to 1400 MPa in different model systems. The isobaric/isothermal kinetics of studied enzymes indicated deviations from simple first-order kinetics in the pT domain investigated and, therefore, were described by using a nth-order reaction model. An order of 1.4 (β-amylase), 1.6 (β-glucanase from barley malt), 1.8 (β-glucanase from B.subtilis) and 2.1 (α-amylase) was found to be the minimum of the cumulative standard error of fit and was used for the determination of the inactivation rate constants for all p-T conditions tested. The inactivation kinetics of glucoamylase showed a clear biphasic character due to the existence of two isoenzymes and could be described by a two-fractional-model using first-order kinetics. The change in inactivation rate constants k in response to pressure and temperature were successfully described by using thermodynamically based polynomial equations. Glucoamylase isofraction GA1 appeared to be the most piezo-tolerant enzyme in this study, preserving its activity up to 1200 MPa at temperatures below 60°C. β-amylase looses 95% of its activity when pressurized at 620 MPa and 30 °C for 30 min. At 40°C α-amylase (in the presence of Ca2+ ions) was inactivated by 95% at 720 MPa, GA2 at 810 MPa and β-glucanase lost 95% of its initial activity at approximately 900 MPa (barley malt) and 1100 MPa (B.subtilis) after 30 min. Nevertheless, the enzymes investigated showed a significant stabilization against thermal induced denaturation at approximately 200 (α- and β-amylase), 400 (β-glucanase from barley malt and GA2), 500 (β-glucanase from B.subtilis) and 600 MPa (GA1), respectively. Mathematic models describing the effect of pressure and temperature on enzyme inactivation were then used to correct the apparent enzymatic substrate conversion from the simultaneously occurring enzyme inactivation. This procedure allowed an isolated inspection of the effect of pressure and temperature on the conversion rate constant over a wide range of pressure-temperature combinations. β-glucanase from B.subtilis showed significant higher catalytic activity at elevated pressures and temperatures. However, this was not found for the other enzymes where the catalytic reactions were reduced at increased pressures but strongly enhanced by raising the temperature. For the overall reaction of substrate conversion and simultaneously occurring enzyme inactivation specific pressure-temperature-time combinations were found to give a maximum in substrate conversion. Individual maxima were found at 165 MPa and 66°C (α-amylase), 106 MPa and 60°C (β-amylase), 220 MPa and 55°C (β-glucanase from barley malt), 270 MPa and 80°C (glucoamylase in the presence of maize starch), 307 MPa and 63°C (β-glucanase from B.subtilis) and 318 MPa and 84°C (glucoamylase in the presence of maltose monohydrate) after 30 min exposure time. Compared to the maximal rate at ambient pressure theses optimal p-T conditions provide an acceleration of enzymatic catalysis of 20-400%. The loss in birefringence has been used as an indicator of maize starch granule gelatinization in response to pT combinations in the range 0.1-650 MPa and 30-75°C. The granule gelatinization at ambient pressure as well as under high pressure followed a reaction order of 1.65. Using a sigmoidal secondary model with the melting temperature (Tm) as reference point, the rate constant is given as a function of pressure and temperature. The rate of birefringence loss was found to be temperature dependent, only, unless the pressure is exceeding 300 MPa. At those pressures, the isorate lines are bended to the left, indicating that starch gelatinization is occurring at lower temperatures. At 30°C, complete gelatinization of maize starch was found after a treatment at 650 MPa for 30 min. Finally it was shown that the saccarification of native maize starch granules by glucoamylase was approximately 2.5 fold higher at optimal pT conditions compared to optimal conditions at ambient pressure. Due to the higher thermo-stability of glucoamylase under high pressure conditions the process temperature could be increased to a level where the inert starch granules convert into an enzymatic digestible substrate within extremely short times. Furthermore, it was proven that the enzymatic conversion of barley malt can be accelerated by increasing the pressure and temperature which reduces the process time by 25%.