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Improved pyrrolysyl-tRNA synthetase derived orthogonal translation systems
Koch, Nikolaj Georg
Site-specific incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into proteins has emerged as a universal tool for systems bioengineering at the interface of chemistry, biology, and technology. Introducing ncAAs by engineered orthogonal pairs of aminoacyl-tRNA synthetases and tRNAs has proven to be a highly useful for the expansion of the genetic code. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) from methanogenic archaeal species is particularly attractive due to its natural orthogonal reactivity in bacterial and eukaryotic cells. However, the scope of such a reprogrammed translation is often limited, due to low yields of chemically modified target protein. This can be the result of substrate specificity engineering, which decreases the aminoacyl-tRNA synthetase stability and reduces the abundance of active enzyme. Additionally, the substrate scope of the PylRS system is limited to amino acids with long and/or bulky side chains. These two main drawbacks of the PylRS system were successfully tackled in this work to increase the usefulness of this already widely used system. To increase the protein production yield, the ncAA incorporation efficiency was increased with two strategies. In the first strategy it could be shown that the solubility and folding of engineered PylRS enzymes can become a bottleneck for the production of ncAA-containing proteins in vivo. Solubility tags derived from various species provided the means to remedy this issue and enhanced the production of site-specifically labelled proteins for a variety of engineered PylRS variants by 200–540%, even the wild-type enzyme gained up to 245% efficiency. The second strategy involved PylRS enzymes from extremophilic organisms. Here, it could be shown that the PylRS from the psychrophilic organism Methanococcoides burtonii (MburPylRS) was a superior system in regard to ncAA incorporation efficiency. Especially impressive was the ability to incorporate multiple ncAAs with good yield into a target protein in comparison to the todays widely used PylRSs systems. This was not only true for the wild-type MburPylRS, even an engineered variant to incorporate S-allyl-L-cysteine experienced almost wild-type activity. An engineered PylRS with wild-type target protein production capabilities has never been described before. Fortunately, I could also show that the known substrate promiscuity of psychrophilic enzymes is also true for MburPylRS.
This is very fortunate since the combination of the very high catalytic activity of MburPylRS and the greater substrate promiscuity could potentially give rise to a plethora of applications that were previously not possible due to the limitations of the PylRS system mentioned above. Considering, that there are only two other orthogonal translation systems (OTSs) known to come close to wild-type recombinant protein production levels (Methanocaldococcus janaschii1–3 and Archaeoglobus fulgidus, both TyrRS systems), the addition of a third OTS to this group is highly desired. This improves the probability that the number of different ncAAs that can be simultaneously incorporated with good efficiency can be increased. In this context, the most promising improvements can be expected with the MburPylRS system in conjunction with semi-synthetic organisms possessing liberated codons, since the tRNAPyl anticodon can be freely chosen. This could be a crucial step closer to creating xenobiotic organisms.
To address the limited substrate range of PylRS systems I engineered PylRS variants capable of incorporating an entire library of aliphatic “small-tag” ncAAs. In particular, mutational studies of a specific PylRS, designed to incorporate the shortest non-bulky ncAA (S-allyl-L-cysteine) possible to date were performed to gain insights of the structure activity relationship. Based on this knowledge aliphatic ncAA derivatives were incorporated and also key residues responsible for maintaining orthogonality, while engineering the PylRS for these interesting substrates were determined. Based on the known plasticity of PylRS toward different substrates, this approach further expands the reassignment capacities of this enzyme toward aliphatic amino acids with smaller side chains endowed with valuable functionalities.
Der ortsspezifische Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAAs) hat sich als Technologie etabliert, die es erlaubt maßgeschneidert biologische Systeme zu manipulieren und findet vielfältige Anwendungen in Bereichen der Lebenswissenschaften (Biochemie, synthetische Biologie, Biophysik). Um den genetischen Code mit ncAAs zu erweitern, haben sich orthogonale Paare von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und tRNAs als besonders nützlich erwiesen. Speziell die Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (PylRS), die von methanogenen Archaeen stammt, ist besonders wertvoll, da sie sowohl in Bakterien- als auch in Säugetierzellen eingesetzt werden kann. Leider ist der Anwendungsbereich mittels PylRS umprogrammierten Zellen zurzeit noch relativ limitiert, da nur geringe Ausbeuten von gewünschtem, mit ncAAs modifizierten, Zielprotein erhalten wird. Ein Grund für diese geringen Ausbeuten kann sein, dass die verwendeten engineerten Enzyme weniger stabil sind und somit weniger aktives Enzym in den Zellen vorliegt, um das gewünschte Zielprotein herzustellen. Eine weitere Limitierung, ist das zurzeit nur ncAAs die sehr voluminös und/oder lang sind, mittels des PylRS-Systems eingebaut werden können. Diese beiden Nachteile wurden in dieser Arbeit gezielt in Angriff genommen und erfolgreich minimiert. Diese deutlichen Verbesserungen in katalytischer Effizienz und Erhöhung der Substraterkennung macht das ohnehin schon sehr weit verbreitete PylRS-System noch nützlicher und breiter anwendbar. Die Ausbeutenerhöhung wurde mittels zweier Strategien verfolgt. Die erste Strategie bestand darin mehr lösliches und damit auch mehr funktionales Enzym in der Zelle zu erhalten, indem Löslichkeits-Tags aus verschiedenen Organismen an die PylRS fusioniert wurden. Dies hat zu beträchtlichen Zielproteinausbeutenerhöhungen geführt (zwischen 200-540%). Selbst das nicht engineerte PylRS-Enzym konnte an Einbaueffizienz gewinnen. In der zweiten Strategie wurde die Nutzung von PylRS-Systemen aus extremophilen Organismen verfolgt. Es konnte gezeigt werden, dass das PylRS-System aus dem psychrophilen Organismus Methanococcoides burtonii allen anderen PylRS-Systemen (MburPylRS) weit überlegen ist. Speziell der Einbau von mehreren ncAAs in ein Zielprotein war bemerkenswert effizienter als mit allen bisher verwendeten PylRS-Systemen. Dies galt nicht nur für das Wildtyp-Enzym, selbst ein engineertes MburPylRS-Enzym, welches S-Allyl-L-cystein (Sac) einbaut, erreichte ähnliche Effizienzen. So etwas konnte noch nie über ein PylRS-System berichtet werden. Glücklicherweise stellte sich auch die für psychrophile Enzyme bekannte, erhöhte Substratpromiskuität als zutreffend für das MburPylRS-Enzym heraus.
Die Kombination aus erhöhter katalytischer Effizienz und erhöhter Substratpromiskuität ist eine wirklich glückliche Fügung, welche dazu führen könnte, dass eine Reihe von weiteren Anwendungen basierend auf diesem System entwickelt werden könnten, die bis jetzt nicht möglich waren, wegen der oben beschriebenen Limitierungen. Es gibt bis heute nur zwei orthogonale Translationssysteme (OTSs) die mit ncAA modifizierte Zielproteine in ähnlicher Ausbeute herstellen können wie die Wildtyp-Proteine-Äquivalente. Diese stammen von Methanocaldococcus janaschii1–3 und Archaeoglobus fulgidus (beides TyrRS Systeme). Ein drittes OTS in dieser Riege wäre deshalb äußerst wertvoll, weil somit die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass mehrere verschiedene ncAAs gleichzeitig und bei guten Ausbeuten eingebaut werden können. In diesem Zusammenhang besteht das größte Entwicklungspotential in der Kombination aus diesen OTS in Verbindung mit semi-synthetischen Organismen, welche Codons besitzen die von ihrer eigentlichen genetischen Information befreit wurden. Diese könnten mit dem PylRS OTS neu belegten werden, da das Anticodon der tRNAPyl frei gewählt werden kann. Das könnte ein wichtiger Schritt zur Erstellung von xenobiotischen Organismen sein.
Um die Substratlimitierung des PylRS-Systems zu beheben, wurden Varianten engineert, die ncAAs mit kleinen aliphatischen Seitenketten einbauen können. Dies war die folgt möglich. Zuerst wurden Mutationsstudien mit einer PylRS Variante durchgeführt, die die bis heute die kleinste ncAA einbauen konnte, Sac. Basierend auf den Erkenntnissen dieser Struktur-Wirkungsbeziehungen wurden PylRS Mutanten entwickelt, die die kleinen aliphatischen ncAAs einbauen konnten. Außerdem konnten Schlüsselpositionen in der PylRS festgestellt werden die das zukünftige engineeren dieses Systems deutlich vereinfachen wird. Es ist äußerst wahrscheinlich, dass sich aufgrund der Plastizität der PylRS und den hier gewonnenen Erkenntnissen noch viele weitere biotechnologisch nützliche kleinere ncAAs in Zielproteine einbauen lassen werden können.
