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Theoretical studies for the development of a better understanding of cofactor-structure and mechanistic properties of photoreceptors and metallo-enzymes with quantum chemical and molecular dynamical approaches
Belger, Dennis Heinz
In this work two phytochromes, namely Cyanobacterial phytochrome Cph1 and Agrobacterium tumefaciens phytochrome Agp2, as well as formate dehydrogenase of Rhodobacter Capsulatus (RcFDH), are investigated. Part III shows the development and its application of a new polarized force field (polff) for the chromophore-binding domain (CBD) of Cph1, derived by QM-computations of Mulliken charges. This addressed stability-issues inside the CBD, as revealed by an increased stability during MD-simulations with polff and seen in computed Raman-spectra (QM/MM). The implementation of polarization effects led to a better agreement of computed spectra with experiments, especially in terms of the NH-in-plane rockings, which were due to less fluctuating water-molecules. Thus, application of polff leads to a stabilization of the water network in MD-simulations and can be used for more accurate spectra-computations.
Part IV illustrates the investigation of the Agp2 CBD in its parent Pfr-state. QM/MM methods have been used for determination of the correct protonation state of the two conserved histidine residues His248 and His278. Comparison of different protonation models with the corresponding X-ray structure. revealed an Nε - and Nδ-protonation for His248 and His278, respectively. Furthermore, QM/MM- and MD-techniques have been applied to different variants of Agp2, with the chromophore Biliverdine (BV) methylated on either propionic side-chain (BVMB or BVMC). Comparison to the crystal structure revealed a high flexibility of Arg211 in BVMB. CH3 on ring B induced a stable opening of the CBD not to be observed in the wild-type (WT). Contrasting this, BVMC showed a highly unstable His278 and CBD. This (together with experimental studies) led to the hypothesis that BVMB is photoactive, because of its ability to produce a stable CBD after initial rearrangements. BVMC could be photoinactive, due to the highly unstable CBD.
Part V shows studies of RcFDH, which catalyzes the reversible oxidation of formate to carbon dioxide. The coordination of the Mo-containing cofactor (Moco) in its different oxidation states (+IV, +V, +VI) has been determined by quantum mechanical (QM) geometry optimizations and computations of Raman-spectra of different GDP-excluding models of the Moco with different ligation spheres and further comparison to experimental resonance Raman data: It is always coordinated by two dithiolene moieties. MoVI is further ligated to a native Cys386 residue and a sulfido-ligand and thus hexacoordinated. The MoIV-species lacks (at least temporarily) the Cys-ligation and is pentacoordinated by a sulfido-ligand (or temporarily thiol-group) and two dihtiolenes. These findings and additional bond dissociation enthalpy computations of different ligand-metal bond systems revealed a new mechanistic understanding. Formate does not bind directly to MoVI. In contrast to that, Cys386 stays coordinated to MoVI, while in MoIV Cys leaves the metal. Possible formal hydride-transfer from formate is mediated by the sulfido-ligand leading to the reduction of molybdenum to MoIV and temporarily forming a SH-ligand at MoIV which further translocates a proton to Cys386 and afterwards deeper into the protein. Subsequently, after CO2 is released from the active-site Cys386 is returning to the metal-site and two electrons are released from the metal and the cycle can start anew. The on-and-off-going of Cys386 may be mediated by the formation of a disulfide-bridge with the sulfido-ligand. A MoV species may participate in step-by-step 1-e--reduction. These findings represent an improved and extended version of the Moco and the catalytic cycle of RcFDH.
In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Phytochrome untersucht, jenes von Cyanobakterium (Cph1) und das von Agrobacterium tumefaciens (Agp2), ebenso wie die Formiatedhydrogenase von Rhodobacter Capsulatus (RcFDH). Teil 3 zeigt die Entwicklung (mittels QM-berechneter Mullikenladungen) und Anwendung eines neuartigen polarisierten Kraftfeldes (polff) für die Chromophor-Bindungs-Domäne (CBD) von Cph1 dargestellt. Hiermit wurden Stabilitätsprobleme in der CBD behoben, wie in MD-Simulationen (mit polff) und berechneten Ramanspektren (QM/MM) beobachtet werden konnte. Die so berechneten Spektren zeigten eine bessere Übereinstimmung mit experimentellen Daten und wiesen eine schmalere NH-in-plane Schwingungsbande auf. Dies ist auf die Stabilität des Pyrrolwassers auf seiner nativen Position zwischen den Pyrrolringen zurückzuführen. Die Anwendung von polff führt somit zu einer Stabilisierung des Wassernetzwerkes in MD-Simulationen und ermöglicht eine realistischere Berechnung von Schwingungsspektren.
Teil 4 dieser Arbeit zeigt die Untersuchung Agp2 CBD im Pfr-Zustand. QM/MM Techniken sind genutzt worden um den Protonierungszustand der beiden konservierten Histidine His248 und His278 zu bestimmen. Der Vergleich verschiedener Protonierungs-Modelle mit der Kristallstruktur von Agp2, zeigte eine Nε - and Nδ-Protonierung für His248 bzw. His278. Weiterhin wurden mit Hilfe von MD- und QM/MM-Methoden Varianten von Agp2 untersucht, welche eine methylierte Propionatseitenkette (BVMB, BVMC) am Chromophore Biliverdin (BV) aufwiesen. Vergleich mit der Kristallstruktur zeigte, dass Arg211 eine besonders hohe Flexibilität aufweist. CH3 an Ring B induzierte eine Öffnung der CBD unter Einbezug von Arg211, welche in dieser Art nicht im WT simuliert werden konnte. Im Gegensatz dazu, offenbarte BVMC Instabilitäten von His278 und der CBD. Dies führte zu der Hypothese (zusammen mit experimentellen Studien), dass BVMB fotoaktiv sein könnte, da sich hier die CBD der eingeführten Methylgruppe anpassen konnte und am Ende der MD stabil blieb. Im Gegensatz dazu sei BVMC auf Grund der Instabilität in der CBD evtl. nicht in der Lage eine komplette Fotokonversion durchzulaufen.
Teil 5 zeigt Studien der RcFDH, welche die reversible Oxidation von Formiat zu Kohlenstoffdioxid katalysiert. Die Koordination des Mo-Kofaktors (Moco) in den verschiedenen Oxidationsstufen (+IV, +V, +VI) wurde mittels QM-Geometrieoptimierungen und Ramanspektren-Berechnungen verschiedener GDP-ausschließender Modelle, sowie Vergleich mit experimentellen Resonanz Raman Daten ermittelt:Dithiolen bindet an Mo. MoVI ist zudem von Cys386 koordiniert und trägt zusätzlich einen Sulfido-Liganden und ist somit hexakoordiniert. MoIV hingegen trägt (zumindest teilweise) keinen Cys-Liganden und ist pentakoordiniert. Das Metall ist von zwei Dithiolenen und einer Sulfido-Gruppe (evtl. auch temporär von einer Thiol-Gruppe) koordiniert. Zusammen mit der Berechnung von Bindungsbrechungsenthalpien verschiedener Metall-Liganden-Bindungen lieferte dies ein neues Verständnis des möglichen Reaktionsmechanismus: Formiat bindet nicht direkt an MoVI, im Gegensatz zu Cys386, welches an MoVI koordiniert (aber MoIV verlässt). Ein möglicher Hydridtransfer des Formiatprotons ist mittels des Sulfido-Liganden unter Ausbildung einer temporären SH-Gruppe am Moco und Reduktion des Metalls zu MoIV möglich. Das Proton wird dann sehr schnell weiter zum negativ geladenen Cys386 geleitet, von wo es tiefer in das Protein transportiert wird. Nach dem Verlassen von CO2 koordiniert Cys386 wieder an das Metall, welches zwei Elektronen abgibt (MoIV → MoVI) und der Zyklus kann von vorne beginnen. Die Abspaltung und Bindung von Cys386 vom bzw. zum Metall könnte dabei mittels der Ausbildung einer Disulfidbrücke mit dem Sulfido-Liganden vonstatten gehen. Ebenfalls ist es möglich, dass die Elektronen Schritt für Schritt über eine MoV-Zwischenstufe übertragen werden. Die hier gezeigten Ergebnisse führen eine verbesserte und erweitere Version des Moco und katalytischen Zyklus der RcFDH ein.
