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In vitro und in vivo Charakterisierung von Endothelvorläuferzellen
Frauenschuh, Jörg
Die Bedeutung der klinischen Forschung an Stamm- und Vorläuferzellen besonders im Bereich der Geweberegeneration hat im Laufe der letzten Jahre deutlich zugenommen. Stammzellen aus adulten Organismen werden in endodermale, ectodermale und mesodermale Stammzellen, welche endotheliale Vorläuferzellen bilden, unterschieden. Diese Vorläuferzellen wurden in der vorliegenden Arbeit auf Transkriptions- und Translationsebene charakterisiert. Ihre Funktion bei der Angiogenese, speziell der Tumorangiogenese war von besonderem Interesse. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Klärung, ob sich endotheliale Vorläuferzellen als Surrogatmarker für antiangiogene Therapien verwenden lassen. Die Endothelvorläuferzellen wurden aus humanem peripherem Blut sowie Nabelschnurblut mittels des Oberflächenproteins AC133, welches Stamm- und Vorläuferzellen charakterisiert, isoliert und als AC133 positive Vorläuferzellen bezeichnet. Die Expression spezifischer Proteine für Stamm- und Vorläuferzellen (AC133, CD34 und cKit) und für bestimmte Blutzellarten (CD45 und CD13) wurde mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR sowie der FACS Analyse nachgewiesen. Endothelzell-spezifische Marker (VEGFR-2 und vWF) konnten nur zum Teil detektiert werden. Die Kokultur der AC133 positive Vorläuferzellen mit anderen Zellen (Endothelzellen, mononukleäre Blutzellen und Promyeloblasten) führte zu einer Änderung in der Expressionsstärke dieser Marker. Die Affymetrix Chip Analyse zeigte eine Überexpression hämatopoetischer Proteine in AC133 positive Vorläuferzellen. Die Rolle dieser Zellen bei der Tumorangiogenese wurde im Mausmodell untersucht. Histologisch wurde ein irregulärer Einbau der AC133 positive Vorläuferzellen im Stroma des Tumorgewebes nachgewiesen. Endothelzellen (MVEC), welche in einem Parallelversuch injiziert wurden, fanden sich teilweise in den Gefäßen. Zur weiteren Klärung der Rolle von Vorläuferzellen wurden murine GFP positive transfizierte Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in einem syngenen Modell eingesetzt. Sie wurden im Stroma des Tumorgewebes sowie im Thymus detektiert. Entgegen der ursprünglichen Annahme, dass es sich bei den AC133 positive Vorläuferzellen um endotheliale Vorläuferzellen handelt, konnte im Laufe dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese Zellen eher hämatopoetische Vorläuferzellen sind. Es ließ sich kein direkter Einfluss bei der Tumorangiogenese nachweisen. Ein Einsatz der Vorläuferzellen als Surrogatmarker für antiangiogene Therapien ist somit eher unwahrscheinlich.
The importance of stem and precursor cells specifically in the field of tissue engineering has strongly increased in the past 5 years?. Stem cells in the adult organism are classified as ectodermal, endodermal and mesodermal stem cells, which differentiate amongst others to endothelial precursor cells (EPC). In this dissertation the endothelial precursor cells were characterized on a transcriptional and translational level. Their function in angiogenesis, especially in tumour angiogenesis was another focus of interest. An aspect was also to clarify if endothelial precursor cells can function as a surrogate marker for anti-angiogenesis therapies. The EPC were isolated from human adult and cord blood via AC133 Microbeads selection and stated as AC133 positive precursor cells. The expression of specific proteins for stem cells (AC133, CD34 and cKit) as well as proteins for different blood cell types (CD45 and CD13) could be detected using real-time RT-PCR and FACS analysis but the expression of specific endothelial proteins VEGFR-2 and vWF could not be measured. A co-culture with other cells (MVEC, PBMC or promyeloblasts) resulted in a change in the expression of these markers. The affymetrix chip analysis showed an over expression of haematopoietic proteins in these AC133 positive precursor cells. The role of the AC133 positive precursor cells in tumour angiogenesis was evaluated within a mouse model. AC133 positive precursor cells could also be found in the tumour mass but there was no direct integration into the blood vessels. The same result could be documented with differentiated endothelial cells as well as bone marrow cells. These cells were also found in the tumour mass but no direct integration in the blood vessel of the tumour could be documented. In contrast to the primary assumption that AC133 positive precursor cells are endothelial precursor cells, it could be shown that they are more likely to be of haematopoietic origin. No direct role in tumour angiogenesis of these cells could be demonstrated. Therefore the use of AC133 positive precursor cells as surrogate marker in anti-angiogenesis therapies is unlikely.
