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Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae using antisense hammerhead ribozymes
Vilches Gonzalez, Sonia Carolina
In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Strategie entwickelt, um die Expression des PGK1 Gens, das für die Phosphoglycerat-Kinase der Glycolyse kodiert, mittels trans-agierenden Hammerhead Ribozymen zu verringern. Die Ribozyme wurden anhand der Computer vorausgesagten Sekundärstruktur von PGK1mRNA konzipiert und ausgewählt. Es wurden drei verschiedene Systeme getestet, um die Ribozyme an ihren Bestimmungsort zu bringen. Diese Systeme machten die Erstellung eines pgk1 knock-out Stamms und die Entwicklung von PGK1/Ribozym-exprimierenden Plasmiden nötig, um eine stabile Akkumulation von Ribozymen und die Co-Lokalisation mit der Ziel mRNA zu erreichen. Um einen hohen Expressionslevel der Ribozyme zu gewährleisten, wurden die Ribozyme unter Verwendung des pIIIEx423 RPR Plasmids in dessen RPR1 Kassette eingefügt. RPR Plasmide enthalten den intragenischen Polymerase III Promotor des S. cerevisiae RNase P RNA Gens (RPR1). Die Fusion dieser Sequenz mit Ribozym-Sequenzen führt zu einer stabilen Akkumulation der RNA-Moleküle. Um die Transspaltungs-Aktivität der Ribozyme und deren Effekt auf die Polymerase II abhängige Expression des PGK1 Gens zu untersuchen, wurden verschiedene Techniken angewendet, die es erlauben, die Spaltungsaktivität zu messen (Northern Blot, Primer Extension, Pgk1 Aktivitätsmessungen, Analyse der Glycerinproduktion). Computergestützte Vorhersagen der Sekundärstruktur, die durch in vitro Experimente ergänzt wurden, sind ein erster Schritt bei der Auswahl von Ziel-RNAs. Spaltungs-Untersuchungen der Ribozyme bestätigten, dass die am Startcodon der Translation lokalisierte Sequenz als ein zugängliches und effizientes Ziel zur Entwicklung von trans-agierenden Hammerhead Ribozymen genutzt werden kann. Diese Sequenz ist häufig als Consensus Sequenz AUGUC am Beginn von Hefe-Genen zu fin n. Des weiteren ist die 3 nicht-translatierte Region des Zielgens, die cis Sequenzen enthält, die zur spezifischen Lokalisation des Transkripts führen, nützlich in der Ribozymentwicklung. Die Fusion der 3 nicht-translatierten Region des PGK1 Gens mit dem Ribozym für den AUGUC Consensus führte zu einer erhöhten Glycerinproduktion, was auf eine verbesserte Spaltungsaktivität hindeutet. Der positive Effekt der 3 nicht-translatierten Region in der Lokalisation von trans-agierenden Ribozymen konnte somit bestätigt werden. In der Regel ist eine Kombination der beiden genannten Sequenzbereiche zum Ribozymdesign sinnvoll. Auch bestätigte die Analyse durch Northern Blots, dass die Verwendung der RPR1 Sequenz zur erhöhten Expression von Ribozymen führt. Die Sekundärstrukur der RPR1 Sequenz behinderte die in vivo und in vitro Spaltungsreaktion der Ribozyme nicht. Das Verständnis und Wissen über den RNA Stoffwechsel sind eine wichtige Grundlage für die Entwicklung effektiv spaltender Ribozyme in Hefe. Die Co-Lokalisation von Ribozym- und Ziel Gen auf demselben Plasmid garantieren nicht eine hohe Spaltungsaktivität, wenn für die RNAs verschiedene Transkriptionssysteme verwendet werden. Die räumliche Verteilung der Polymerase II und III Systeme und die Organisation im Kern während der Transkription lassen eine effiziente Interaktion zwischen Ziel-Sequenz und Ribozym kaum zu. Zahlreiche Proteine und Faktoren, die in der Prozessierung und beim Transport an die RNA binden, wie auch der Transport von Ribozymen vom Kern zum Cytoplasma und ein hoher Expressionslevel sind wichtige Größen, die die Wirkung eines Ribozyms beeinflussen. Hierbei muss allerdings berücksichtigt werden, dass die Verwendung hochexprimierender, episomaler Vektoren zu einer Reduzierung der Vitalität der Hefe führen kann, die die Bestimmung der Ribozymwirkung erschwert.
In this work, a novel strategy was developed to decrease the expression of the PGK1 gene encoding the phosphoglycerate kinase of the glycolytic pathway by trans-acting hammerhead ribozymes. We selected and designed ribozymes for cleavage of the PGK1mRNA based on the prediction of its secondary structure. To deliver the ribozymes three different systems were tested. These systems required the creation of a pgk1 knock-out strain and plasmid constructs expressing PGK1/Ribozyme to achieve a stable accumulation of ribozymes co-localizing with the target mRNA. The ribozymes were inserted into the RPR1 cassette using the pIIIEx423 RPR plasmid to allow high ribozyme expression. RPR plasmids contain the intragenic polymerase III promoter from the S. cerevisiae RNase P RNA gene (RPR1). The fusion of this leader to RNAs leads to stable accumulation of these molecules. In order to analyze the ribozyme trans-cleavage activity and its effects on the polymerase II dependent expression of PGK1, different techniques to investigate the cleavage activity were applied (northern blot, primer extension, Pgk1 activity assay and glycerol production analysis). The computer prediction supported by in vitro experiments is an initial step of the target selection. The ribozyme cleavage analyses confirmed the Rz site located at the start translation codon as accessible and efficient for the design of trans-acting hammerhead ribozymes. This site contains the consensus sequence AUGUC found in many yeast genes. Furthermore, the 3' untranslated region of the target gene, which contains cis sequences to specifically localize the transcript, is useful in ribozyme design. The fusion of the PGK1 3 untranslated region to the Ribozyme which is directed to the conse us sequence AUGUC lead to a better result of ribozyme activity in terms of glycerol production. Thus, its use in trans-ribozyme delivery has been newly confirmed. As a rule, a combination of both sequences can be feasible for ribozyme design. Likewise, the northern blot analyses confirmed the use of the RPR1 leader as useful for high ribozyme expression. The secondary structure of the RPR1 leader did not interfere with the in vivo and in vitro cleavage activity of the ribozymes. The understanding and knowledge of RNA metabolism seem to be an important issue for developing effective ribozyme design in yeast. The co-localization of ribozyme and target genes on the same plasmid does not guarantee cleavage activity when different transcription machineries play a role in their gene expression. The spatial distribution of polymerases II and III systems and the nuclear organization when transcription takes place, hampers an efficient interaction between target and ribozymes. The numerous proteins and factors binding the RNA, either in processing and trafficking, as well as the transport of ribozymes from nucleus to cytoplasm and the high level of expression are all important factors to be considered for designing more efficient ribozymes. Moreover, the use of high-copy-number episomal plasmids caused reduced yeast vitality that complicated the determination of the ribozyme effect.
