Loading…
State-of-the-art mass spectrometry for the discovery and identification of biodiverse natural toxins
Hempel, Benjamin-Florian
Nowadays natural toxins, fascinating and sophisticated biochemical products in all forms of life, play an exceptional role in human health and peptide drug discovery. Natural toxins and their biochemical features reflect two sides of a coin, either associated to historical terrible disasters responsible for innumerable death and permanent health issues, or chemical lead structures for the development of lifesaving drugs against some of major global burdens.
The introduction of mass spectrometry, a major key player of analytical spectrometric instruments in mid of the 20th century, resulted in many well-funded, large-scale screening programs and gained momentum for the analysis of medically important toxins of various origin. Down to the present day, several technical improvements of analytical sciences helped to get a deeper insight to complex biological systems and understanding of the mode of action for toxigenic agents. The investigations resulted in manifold clinical drugs based on natural-derived toxins.
The present thesis is dealing with the identification and biochemical biosynthesis investigation by different state-of-the-art mass spectrometry technologies of biodiverse natural toxins, both exotoxins and zootoxins. In addition, several toxic components from highly complex snake venoms were evaluated for potential application as cytoxic agents against cancerous cell lines.
The first part of the thesis is dedicated to biosynthesis investigations of the nonribosomal-polyketide hybrid albicidin. The phytotoxin is produced by the xylem-invading sugarcane pathogen, Xanthomonas albilineans, causing chlorosis by interrupt the plant DNA replication. Albicidin blocks the plant and prokaryotic specific topoisomerase IV by interference in the DNA binding subunit A. The biosynthesis of albicidin revealed the incorporation of different para-aminobenzoic acid (pABA) variants, para-coumaric acid (pCA), and β-cyanoalanine (β-Cya). In chapter 2 we found, besides the main albicidin metabolite, an N-terminal modified derivative by untargeted mass spectrometry metabolomics experiments from wild strain cultures of X. albilineans. The carbamoylated albicidin derivative was characterized by in vivo and in vitro biochemical investigations. The post-NRPS modification by the carbamoyltransferase Alb15 in the biosynthesis cluster of albicidin was confirmed by gene inactivation and in vitro experiments by the heterologously expressed enzyme. Conclusively, chemical synthesis of carbamoyl-albicidin enabled us to test bioactivities by means of in vitro gyrase and antibacterial inhibition assays. Chapter 3 gives a closer insight in the inter-NRPS modification of incorporated pABA derivatives. Interestingly, substrate specificity experiments for respective adenylation domains revealed a preferential incorporation of the substrate para-3-hydroxy-aminobenzoic acid (pABA-3OH) rather than previously mentioned para-2-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid (pMBA). The biosynthesis gene alb02 encodes a putative S-adenosylmethionine (SAM)-dependent O-methyltransferase, which was in vitro characterized by comprehensive substrate screening and substrate-dependent kinetics. Top-down mass spectrometry experiments on crypto-PCP domains loaded with precursor pABA-3OH were carried out to track the in situ modification to para-amino-3-methoxybenzoic acid (pABA-3OMe). In combination with NMR spectroscopy and crosslinking mass spectrometry, we examined a transient substrate-controlled interaction that so far has not been described and impact our understanding of the assembly line logic.
In the second part of the thesis, we combined standard and alternatively introduced mass spectrometry-guided workflows to depict venom variations on the level of population or within different species. The detailed venom analysis of postulated subspecies by different venom proteomics strategies allowed us to show a remarkable agreement of the venom compositions that can help to overcome the controversial question of the taxonomic status of Vipera ammodytes transcaucasiana. In addition, we tested venom constituents in chapter 4 for a cytotoxic bioactivity screening and found exceptional results for the human breast adenocarcinoma epithelial MDA-MB-231 cell line. In chapter 5, we introduced a combined approach that enabled us for a faster and more detailed comparison of venom proteomes from multiple specimens. We identified intraspecies venom variations of Vipera kaznakovi individuals, and find these were mainly driven by the age of the animals. In chapter 6, we report on the venom proteome of Vipera anatolica senliki and an alternative in-source decay (ISD)-based proteomics workflow. Top-down ISD venomics allowed for disulfide bond counting and effective de novo sequencing of high-molecular-weight venom proteoforms, both of which are difficult to achieve by the commonly established top-down approach.
Finally, in chapter 7 perspectives for future directions of state-of-the-art mass spectrometry techniques are briefly discussed and exemplary experiments outlined.
Heutzutage spielen natürliche Toxine in einer Vielzahl von verschiedensten Lebensformen, als hoch spezialisierte und faszinierende biochemische Produkte, eine außergewöhnliche Rolle für die Entdeckung neuer peptidbasierter Arzneimittel und die menschliche Gesundheit. Natürliche Toxine und ihre biochemischen Eigenschaften spiegeln zwei Seiten einer Medaille wider, denn entweder werden sie mit historischen Katastrophen sowie unzähligen Todesfällen und dauerhaften Gesundheitsproblemen assoziiert, oder als chemische Leitstrukturen für die Entwicklung lebensrettender Medikamente gegen einige der größten globalen Herausforderungen.
Die Einführung der Massenspektrometrie, eine Schlüsseltechnologie in der analytisch-quantitativen Lebenswissenschaft, spielte Mitte des 20. Jahrhunderts eine wichtige Rolle und führte zu vielen gut finanzierten sowie groß angelegten Screening-Programmen welche für die Analyse von medizinisch relevanten Toxinen verschiedener Herkunft schnell an Dynamik gewannen. Bis heute haben verschiedene technische Verbesserungen der analytischen Wissenschaften dazu beigetragen einen tieferen Einblick in komplexe biologische Systeme zu bekommen und ein besseres Verständnis der Wirkungsweise von Toxigenen zu erhalten. Die Untersuchungen ergaben vielfältige klinische Medikamente, die auf natürlichen Toxinen basieren.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Identifizierung und Untersuchung der biochemischen Biosynthese von biodiversen natürlichen Toxinen, sowohl Exotoxinen als auch Zootoxinen, mittels unterschiedlicher hochmoderner Massenspektrometrie-Technologien. Zusätzlich wurden verschiedene toxische Komponenten von hochkomplexen Schlangengiften auf den potenziellen Einsatz als zytotoxische Wirkstoffe gegen Krebszelllinien untersucht.
Der erste Teil dieser Arbeit untersucht die Biosynthese des nonribosomalen Sekundärmetaboliten Albicidin. Das Phytotoxin wird durch das Xylem-befallenden Zuckerrohr-Pathogen Xanthomonas albilineans produziert, welcher die Chlorose durch Störung der pflanzlichen DNA Replikation verursacht. Albicidin blockiert die für Pflanzen und Prokaryoten spezifische Topoisomerase IV durch Interaktion in der DNA-Bindungsuntereinheit A. Biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Albicidin zeigten den Einbau von verschiedenen para-Aminobenzoesäure (pABA) Varianten, para-Cumarsäure (pCA) und β-Cyanoalanin (β-Cya). In Kapitel 2 fanden wir neben dem Albicidin-Hauptmetaboliten ein N-terminal modifiziertes Derivat mittels ungezielter massenspektrometrischer und metabolomischer Experimente in X. albilineans Wildtyp-Kulturen. Im Folgenden wurde die post-NRPS Modifizierung durch die Carbamoyltransferase Alb15 mittels Geninaktivierung und in vitro Experimente mit dem heterolog exprimierten Alb15 Enzym bestätigt. Abschließend ermöglichte uns die chemische Synthese von Carbamoyl-Albicidin die Testierung der Bioaktivitäten mittels in vitro Gyraseinhibierung und dessen antibakteriellen Eigenschaften. In Kapitel 3 konnten wir einen tieferen Einblick in die in situ Modifikation der eingebauten pABA Derivate gewinnen. Interessanterweise offenbarten Substratspezifitäts-Experimente für die entsprechenden Adenylierungsdomänen einen selektiven Einbau des Substratmonomers para-3-Hydroxy-Aminobenzoesäure (pABA-3OH) anstelle der im Albicidin identifizierten para-2-Hydroxy-3-Methoxybenzoesäure (pMBA). Das Biosynthese-Gen alb02 kodiert für eine putative S-Adenosylmethionin (SAM)-abhängige O-Methyltransferase, welche durch ein umfassendes Substrat-Screening und Substrat-abhängige Kinetik in vitro charakterisiert wurde. Top-down Massenspektrometrie-Experimente an crypto-PCP Domänen beladen mit dem Precursor pABA-3OH wurden durchgeführt um die in situ Modifikation zu para-Amino-3-Methoxybenzoesäure (pABA-3OMe) zu beobachten. Mithilfe einer Kombination aus zweidimensionaler NMR Spektroskopie und ´cross-linking` Massenspektrometrie geben wir Einblicke in eine bisher unbeschriebene basale und substrat-gesteuerte in situ Interaktion, die unser Verständnis über die NRPS-gesteuerte Syntheselogik neu definiert.
Im zweiten Teil der Arbeit kombinieren wir standardisierte und alternative Massenspektrometrie-Verfahren um Venomvariationen auf der Ebene von Populationen oder innerhalb verschiedener Spezies abzubilden. Die detaillierte Venomanalyse von postulierten Subspezies, mittels unterschiedlicher Venomproteom-Strategien, erlaubte uns eine bemerkenswerte Übereinstimmung der Giftzusammensetzung darzustellen, die dazu beitragen kann die umstrittene Frage des taxonomischen Status von Vipera ammodytes transcaucasiana zu klären. Zusätzlich haben wir in Kapitel 4 verschiedene Venombestandteile auf zytotoxische Bioaktivität getestet, welche vielversprechende Resultate für humane Brustadenokarzinom-Epithelzelllinien zeigen. In Kapitel 5 etablieren wir einen kombinierten Ansatz zur schnelleren und genaueren Analyse von Venomproteomen mehrerer Individuen. Das Verfahren erlaubte die Identifikation von Venomvariationen in einer Vipera kaznakovi Population, die hauptsächlich auf dem Alter der Tiere basieren. In Kapitel 6 berichten wir von dem Venomproteom der anatolischen Wiesenotter, Vipera anatolica senliki, und die Einführung einer alternativen Identifzierungsmethode für Venomproteome basierend auf dem ´in-source` Zerfall (ISD). Top-down ISD Untersuchungen erlaubt die Identifizierung durch Reduktion und anschließender Zählung der Disulfid-Bindungen, sowie effektive de novo Sequenzierung von hochmolekularen Venom-Proteoformen, was durch den bereits etablierten Top-down Ansatz schwierig ist.
Abschließend diskutieren wir in Kapitel 7 kurz Perspektiven für zukünftige Richtungen moderner Massenspektrometrie-Techniken und zeigen beispielhafte Experimente für die Projekte.
Has Part
