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Incorporation of aromatic non-canonical amino acids in the orange carotenoid protein with spectral signature study using design of pyrrolysyl-tRNA synthetase-based orthogonal translation
Tseng, Hsueh-Wei
A blue-green light photoreceptor protein, the Orange Carotenoid Protein (OCP), carries a single carotenoid molecule that plays the crucial role in the mechanism for photoprotection against strong solar irradiation1. Upon irradiation with blue light, the structure of OCP transforms from the inactive state (orange color) to the active state (red color). Hydrogen bonding between the carotenoid and residues Y201 and W288 of OCP is essential for photoactivity2. Therefore, studying the influence of chemical modifications on these residues is vital to elucidate their functionalities for the spectral properties of OCP. These aromatic residues are site-specifically exchanged by non-canonical aromatic amino acids (ncAAs) incorporation via stop-codon suppression. In this study, variants of Methanosarcina mazei pyrrolysyl tRNA synthetase (MmPylRS) were engineered to recognize, activate, and insert tryptophan and tyrosine analogs in a site-directed manner. Moreover, the mutagenesis strategy also used dramatically improves the efficiency of the orthogonal translation. This approach provides a platform to modify intracellular OCP variants in complex with different chromophores and redesign them with distinct spectral features. This should allow the establishment of spectral settings (e.g., fluorescence) for a non-invasive approach to monitor homogeneity (or heterogeneity) in the biotechnological production of carotene vitamins and their precursors.
Das Orange Carotenoid Protein (OCP) ist ein Photorezeptorprotein für blaugrünes Licht, das ein einzelnes Carotinoidmolekül trägt, dass eine entscheidende Rolle im Mechanismus des Lichtschutzes gegen starke Sonneneinstrahlung spielt1. Bei der Bestrahlung mit blauem Licht verwandelt sich die Struktur des OCP vom inaktiven Zustand (orange Farbe) in den aktiven Zustand (rote Farbe). Die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Carotinoid und den OCP-Resten Y201 und W288 sind für die Photoaktivität entscheidend2. Daher ist die Untersuchung des Einflusses chemischer Modifikationen an diesen Resten von entscheidender Bedeutung, um ihre Funktion für die spektralen Eigenschaften von OCP zu klären. Diese aromatischen Reste werden ortsspezifisch durch den Einbau nicht-kanonischer aromatischer Aminosäuren (ncAAs) mittels Stop-Codon-Suppression ausgetauscht. In dieser Studie wurden Varianten der Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (MmPylRS) von Methanosarcina mazei so verändert, dass sie Tryptophan- und Tyrosin-Analoga erkennen, aktivieren und ortsspezifisch einbauen. Außerdem verbessert die verwendete Mutagenesestrategie die Effizienz der orthogonalen Translation erheblich. Dieser Ansatz bietet eine Plattform, um intrazelluläre OCP-Varianten im Komplex mit verschiedenen Chromophoren zu entwickeln und sie mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften neu zu gestalten. Dies sollte es ermöglichen, spektrale Einstellungen (z. B. Fluoreszenz) für einen nicht-invasiven Ansatz zur Überwachung der Homogenität (oder Heterogenität) bei der biotechnologischen Produktion von Carotin-Vitaminen und ihren Vorläufern festzulegen.
