Entwicklung eines dreidimensional gedruckten humanisierten Lebermodells als Modellsystem für virale Infektions- und Transduktionsversuche
Hiller, Thomas
Die Leber ist das zentrale Stoffwechselorgan des menschlichen Organismus und ist verantwortlich für eine Vielzahl essentieller Stoffwechselvorgänge. Adenovirale Infektionen der Leber können schwerwiegenden Gewebsschädigungen verursachen mit pathologischen Konsequenzen für den menschlichen Organismus. Bestehende antiadenovirale Therapien sind oftmals nur begrenzt wirksam und können zudem starke Nebenwirkungen zeigen. Daher werden insbesondere zur Behandlung immunsupprimierter Patienten alternative Therapieansätze benötigt. In diesen Zusammenhang ist die antiadenovirale Gentherapie vermittelt über RNA-Interferenz und AAV-Vektoren besonders vielversprechend, bedarf jedoch weiterführender Forschung und alternativer Zellkulturmodelle. Dreidimensionale Gewebemodelle bieten als Schnittestelle zwischen klassischen zweidimensionalen Zellkulturen und Tiermodellen eine vielversprechende Alternative innerhalb der biowissenschaftlichen Forschung, da sie sowohl strukturelle Komplexität besitzen als auch die Verwendung von humanen Zellen sowie die Generierung präziser und reproduzierbarer Strukturen ermöglichen. Hierbei ist der Extrusionsdruck nach dem Stand der Technik besonders zellschonened sowie ökonomisch bezogen auf den Biotintenverbrauch und daher eine der biowissenschaftlich am häufigsten genutzten Drucktechniken.
Daher beschreibt die vorliegende Arbeit die Generierung hepatischer Gewebeanaloga mittels pneumatischem Extrusionsdruck, zur Untersuchung adenoviraler Infektionen sowie adeno-assoziierter Virusvektor-vermittelter Gentherapie. Zur Nachbildung möglichst physiologischer Mikrostrukturen innerhalb der generierten Strukturen wurde humane extrazelluläre Matrix als zentrale Biotintenkomponente verwendet und mit HepaRG-Zellen, einer humanen hepatischen Zelllinie, sowie zur Verbesserung der Druckeigenschaften mit Alginat und Gelatine gemischt. Es konnte gezeigt werden, dass Biotinten mit anteilig bis zu 10 % humaner extrazellulärer Matrix optimale Druckeigenschaften besitzen und die Generierung formstabiler sowie definierter dreidimensionaler Strukturen ermöglicht und zudem sowohl die Viabilität als auch den Metabolismus (Albuminsekretion und Cytochrom P450 3A4-Aktivität) der HepaRG-Zellen innerhalb der Strukturen begünstigt. Darüber hinaus konnten entsprechende Strukturen effizient mit adeno-assoziierten Virusvektoren des Serotyp 6 transduziert und parallel das endogen exprimierte Cyclophillin B mittels RNA-Interferenz signifikant herunterreguliert werden. Des Weiteren ermöglichen die generierten dredimensionalen Strukturen die Replikation des Adenovirus Serotyp 5 und die Bildung infektiöser Partikel. Somit wurde deutlich, dass die generierten hepatischen Strukturen zukünftig als Grundlage zur Untersuchung infektiöser Viren und adeno-assoziierter Virusvektoren vermittelter Gentherapie Anwendung finden können.
The liver is the central metabolic organ of the human organism and is responsible for many essential metabolic processes. Adenoviral infections of the liver can cause serious tissue damage with pathological consequences for the human organism. Existing antiadenoviral therapies are often only effective to a limited extent and can also show strong side effects. For this reason, alternative therapeutic approaches are particularly needed for the treatment of immunosuppressed patients. In this context, antiadenoviral gene therapy mediated via RNA interference and AAV vectors is particularly promising, but requires further research as well as alternative cell culture models. Three-dimensional tissue models, as an interface between classical two-dimensional cell cultures and animal models, offer a promising alternative within bioscientific research, as they possess structural complexity and enable the use of human cells and the generation of precise and reproducible structures. According to the state of the art, particularly extrusion printing is cell preserving as well as economical concering bio ink consumption and therefore one of the most frequently used printing techniques in biosciences.
Accordingly, this present study describes the generation of hepatic tissue analogues by pneumatic extrusion printing for the investigation of adenoviral infections and adeno-associated virus vector-mediated gene therapy. To reproduce physiological microstructures within the generated structures, human extracellular matrix was used as the central bio ink-component and mixed with HepaRG cells, a human hepatic cell line, as well as alginate and gelatine to improve the printing properties of the bio inks. It could be shown that bio inks with up to 10 % human extracellular matrix have optimal printing properties and enable the generation of dimensionally stable as well as defined three-dimensional structures and furthermore promote viability and metabolism (albumin secretion and cytochrome P450 3A4 activity) of the HepaRG cells within the structures. In addition, corresponding structures could be efficiently transduced with adeno-associated virus vectors of serotype 6 and the endogenously expressed human cyclophillin B could be significantly silenced by RNA interference. Furthermore, the generated three-dimensional structures allow the replication of adenovirus serotype 5 and the formation of infectious particles. Thus, it became clear that the generated hepatic structures can be used in the future as a basis for the investigation of infectious viruses and adeno-associated virus vectors of mediated gene therapy.
