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Neue Wege der Folsäurebiosynthese

Untersuchungen zum Katalysemechanismus der Aminodesoxychorismat-Synthase des Modellorganismus Bacillus subtilis

Schadt, Heiko

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der para-Aminobenzoesäurebiosynthese(pABA) als Teil der Folsäurebiosynthese des Modellorganismus Bacillus subtilis. Sequenzvergleiche der Aminodesoxychorismat (ADC) Synthase von B. subtilis, die den ersten Schritt der pABA-Biosynthese katalysiert, mit dem bereits charakterisierten homologen Enzym aus E. coli hatten ergeben, dass der wichtigste katalytische Rest des E. coli Enzyms, Lysin 274, bei B. subtilis sowie einigen weiteren Mikroorganismen durch ein Alanin ersetzt ist, welches keinesfalls die Aufgabe des Lysins übernehmen kann. Bei E. coli bildet Lys-274 ein kovalentes Addukt mit dem Substrat Chorismat aus, und aktiviert dieses dadurch für einen nukleophilen Angriff von Ammoniak auf C4 des Chorismats, so dass 4-Amino-4-desoxychorismat (ADC) gebildet und freigesetzt wird. Dieses ADC wird dann durch ein weiteres Enzym, die ADC-Lyase, unter Abspaltung von Pyruvat zu pABA aromatisiert. Die Untersuchung des Katalysemechanismus wurde auf der Basis verschiedener Experimente durchgeführt: So wurde mittels massenspektrometrischer Vermessung des kompletten Proteins gezeigt, dass im Gegensatz zum E. coli Katalysemechanismus tatsächlich kein kovalentes Substrat-Enzym-Intermediat gebildet wird, und bei B. subtilis ein grundlegend anderer Katalysemechanismus vorliegt. Ein weiteres Experiment zur Untersuchung des Katalysemechanismus basierte auf der massenspektrometrischen Analyse der Reaktionsprodukte der ADC-Synthase von B. subtilis im Vergleich zu E. coli. Auch hier zeigten sich grundlegende Unterschiede: Während bei E. coli ausschließlich ADC gebildet wird, entsteht bei der B. subtilis Reaktion noch ein weiteres Reaktionsprodukt, welches als 2-Amino-2-desoxyisochorismat (ADIC) identifiziert werden konnte. Auf der Grundlage dieser und weiterer Experimente wurde ein Katalysemechanismus für die B. subtilis ADC-Synthase als Vertreter der alaninhaltigen ADC-Synthasen postuliert: Chorismat wird durch einen nukleophilen Angriff von Ammoniak, der aus Glutamin stammt, zu ADIC. Ammoniak übernimmt also die Funktion, die im E. coli Enzym die Seitenkette Lys-274 ausübt. ADIC wird dann durch einen zweiten nukleophilen Angriff von Ammoniak, der ebenfalls aus Glutamin stammt, zu ADC. Beide Schritte werden durch die ADC-Synthase katalysiert. In einem dritten, von der ADC-Lyase katalysierten Schritt, wird ADC schließlich zu pABA aromatisiert. Zur Bestimmung der enzymkinetischen Parameter wurde ein geeignetes Assay-System entwickelt, das es ermöglichte, die kinetischen Parameter der ADC-Synthase-Reaktion von E. coli aus der Literatur zu reproduzieren, und die der ADC-Synthase-Reaktion von B. subtilis zu bestimmen.
The present contribution provides a novel variation of para-aminobenzoic acid (pABA) biosynthesis. While in the model organism E. coli, pABA biosynthesis occurs via covalent intermediate formation between chorismate and the enzyme aminodeoxychorismate synthase (ADCS), in Bacillus subtilis, chorismate is converted to the new intermediate, 2-amino-2-deoxyisochorismate (ADIC) by ADCS, which is subsequently transformed to aminodeoxychorismate (ADC) by addition of ammonia, also catalyzed by ADCS. The third step is the aminodeoxychorismate lyase catalyzed elimination of pyruvate from ADC.