Loading…
Modes of anaerobic respiration catalysed by members of the class Dehalococcoidia
Cooper, Myriel
The bacterial class Dehalococcoidia, phylum Chloroflexi, encompasses several cultivated strains and many so far uncultivated bacteria, known from molecular detection of their 16S rRNA gene sequences in marine sediments. All cultivated representatives exclusively respire with halogenated compounds as terminal electron acceptor in a process termed organohalide respiration. However, it is not known whether organohalide respiration can explain the abundance and ubiquitous distribution of Dehalococcoidia in marine pristine sediments. In the current work, electron acceptors for respiration of Dehalococcoidia were investigated with the model organism Dehalococcoides mccartyi strain CBDB1 to gain insight into which properties of halogenated compounds are required to serve as electron acceptor of Dehalococcoidia and might in part explain their abundance at marine sites. For this, a microtiter plate-based assay was established to measure reductive dehalogenase activity – the key enzyme in organohalide respiration. D. mccartyi strain CBDB1 dehalogenated chlorinated benzonitriles, chlorinated anilines and brominated phenols, benzenes, pyridines, furoic and benzoic acids and specific activities of 4.5 to 241 nkat mg^-1 protein were determined. In cultivation experiments, growth yields of 0.1 x 10^14 to 2.3 x 10^14 cells mol^-1 halogen released were obtained with strain CBDB1. Brominated electron acceptors were generally dehalogenated to a further extent than their chlorinated equivalents and showed higher specific activity rates in resting cell assays. Results of shotgun proteomics and activity assays suggest that the same reductive dehalogenases are involved in the dehalogenation of brominated and chlorinated benzenes, indicating chemical properties influence reductive dehalogenation patterns of strain CBDB1. The correlation of density functional theory calculations with microbial and biochemical experiments revealed that functional groups decreasing electron density at the halogen and not at the halogen-substituted carbon enhance reductive dehalogenation. The most positive halogen partial charge predicted the regioselective dehalogenation catalysed by strain CBDB1 for up to 96% of all evaluated molecules. These findings suggest a cobalamin–halogen interaction during reductive dehalogenation which stands in contrast to previous models of reductive dehalogenation. A halogen– cobalamin interaction could in part explain the broad electron acceptor diversity of organohaliderespiring Dehalococcoidia suggesting that a multitude of natural organohalogens – including brominated aromatics – could serve as natural halogenated electron acceptor for respiration and growth of Dehalococcoidia in marine sediments. In addition, the established prediction systems may allow for improved fate prediction of halogenated compounds from anthropogenic or natural sources in the environment. Reductive dehalogenation of brominated aromatics was also shown to occur in marine deep-sea sediment microcosms with activity assays, inhibition studies and cultivation experiments although no Dehalococcoidia were detected. However, the conducted experiments demonstrated that similar dehalogenation patterns observed with model organism strain CBDB1 occur in non-contaminated deep-sea sediments. To investigate the potential of Dehalococcoidia to respire non-halogenated electron acceptors, the genetic information from the single amplified Dehalococcoidia genome SAG-C11 was used to design primers for a newly identified class of dissimilatory sulphite reduction genes (dsr) in Chloroflexi. The primers were used to study sediment samples from different locations and depths for the presence of Chloroflexi-related dsr genes. Several dsr genes located in a similar genetic context as observed in SAG-C11 and affiliating with dsr genes from SAG-C11 in phylogenetic analyses were detected in sediments from Aarhus, the Baffin Bay and in tidal flat sediments of the Wadden Sea. The obtained dsrAB genes shared 71–100% nucleotide sequence identities with dsrAB of SAG-C11 suggesting that dissimilatory sulphite reduction is a more widespread mode of respiration in the class Dehalococcoidia and could contribute together with organohalide respiration of brominated natural electron acceptors to the abundance and ubiquitous presence of Dehalococcoidia in marine sediments.
Die vorliegende Arbeit beschreibt Formen der anaeroben Atmung der bakteriellen Klasse Dehalococcoidia, Abteilung Chloroflexi, welche zu den häufigsten und abundantesten Bakteriengruppen mariner Sedimente gehört und deren kultivierten Vertreter aus terrestrischen Habitaten ausnahmslos auf eine Atmung mit halogenierten organischen Verbindungen (Organohalidatmung) angewiesen sind. Kultivierung und Mikrotiterplatten-basierte Aktivitätstests mit strukturell unterschiedlichen Elektronenakzeptoren zeigten, dass Dehalococcoidia Modellorganismus Stamm CBDB1 chlorierte Benzonitrile, chlorierte Aniline und bromierte Phenole, Benzole, Pyridine, Furonund Benzoesäuren dehalogenierte. Wachstumsausbeuten von 0,1 x 10^14 bis 2,3 x 10^14 Zellen pro Mol freigesetztem Halogen Anion und spezifische Aktivitäten von 4,5 bis 241 nkat pro mg Protein wurden gemessen. Bromierte Aromaten wurden weitergehend und mit höheren spezifischen Aktivitäten dehalogeniert als ihre chlorierten Äquivalente. Aktivitätstests und Shot-Gun Proteomik deuteten darauf hin, dass die gleichen reduktiven Dehalogenasen in die Umsetzung der getesteten bromierten und chlorierten Benzole involviert sind. Bromierte aromatische Verbindungen, die in marine Habitaten vorkommen, könnten somit als natürliche Elektronenakzeptoren für Organohalid-atmende Dehalococcoidia in marinen Sedimenten dienen. Eine reduktive Dehalogenierung bromierter Verbindungen wurde auch in Aktivitätstests mit Zellen aus marinen Sediment-Mikrokosmen und durch Inhibitionsstudien nachgewiesen. Obwohl keine Chloroflexi in den marinen Sediment- Mikrokosmen detektiert werden konnten, zeigten die Experimente, dass reduktive Dehalogenierung auch in marinen nicht-kontaminierten Tiefseesedimenten vorkommen kann. Die Korrelation mikrobiologischer und biochemischer Versuche mit Dichtefunktionaltheorie-basierten Berechnungen verschiedener Partialladungs-Modelle zeigte, dass die regioselektive Dehalogenierung durch Stamm CBDB1 mit Hilfe der positivsten Halogen-Partialladung für 96% der untersuchten Moleküle vorausgesagt werden konnte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass funktionelle Gruppen, die die Elektronendichte am Halogenatom verringern, die reduktive Dehalogenierung unterstützen. Dies weist auf eine Cobalamin–Halogen Interaktion während der reduktiven Dehalogenierung hin und steht im Gegensatz zu bisherigen Modellen der reduktiven Dehalogenierung. Eine Cobalamin–Halogen Interaktion könnte dazu beitragen, das breite Elektronenakzeptoren Spektrum Organohalid-atmender Dehalococcoidia zu erklären und könnte Organohalid-atmenden Dehalococcoidia in marinen Sedimenten erlauben, verschiedenste halogenierte Verbindungen wie z.B. bromierte komplexe Aromaten für die Atmung zu nutzen. In einem weiteren Teil dieser Dissertation wurde mit molekularbiologischen Methoden das Potential von Dehalococcoidia untersucht, nicht-halogenierte Elektronenakzeptoren zu nutzen. Dies könnte die Stratifikation von Dehalococcoidia Subgruppen entlang geochemischer Gradienten erklären. Dazu wurden mit Hilfe der Genominformation einer Dehalococcoidia-Einzelzelle („SAG-C11“) PCR-Primer entwickelt, die spezifisch dsr Gene in Dehalococcoidia amplifizierten. Mit diesen Primern wurden das Vorkommen und die Diversität der dissimilatorischen Sulfitreduktase (dsr) in Dehalococcoidia in Sedimenten verschiedener Orte und Tiefen untersucht. Unterschiedliche dsr Gene, die sich in einem ähnlichen genetischen Kontext wie in SAG-C11 befanden und in phylogenetischen Analysen mit dsr Sequenzen aus SAG-C11 gruppierten, wurden in Sedimenten der Aarhusbucht, der Baffinbucht und in Wattsedimenten der Nordsee nachgewiesen. Nukleotidsequenzähnlichkeiten von 71–100% der aus marinen Sedimenten amplifizierten dsrAB-Sequenzen zu den dsrAB-Sequenzen aus SAG-C11 weisen darauf hin, dass dissimilatorische Sulfitreduktion ein verbreiteter Atmungsprozess in Dehalococcoidia ist und zusammen mit der Organohalidatmung bromierter Verbindungen zu einer Erklärung der ubiquitären Verbreitung von Dehalococcoidia in marine Sedimenten in unterschiedlichen biogeochemischen Zonen beitragen kann.
