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Instrumental analysis, metabolism and toxicity of cis- and trans-zearalenone and their biotransformation products
Drzymala, Sarah Stephanie
trans-Zearalenon (ZEN) ist ein nicht-steroidales östrogenwirksames Mykotoxin, das weltweit Getreide kontaminiert. Tiere und Menschen können nach Aufnahme von befallenen Lebens- oder Futtermitteln zahlreiche Mykotoxikosen entwickeln, die auf der östrogenen Wirkung von ZEN beruhen. Strukturell zeichnet sich ZEN durch eine trans-konfigurierte Doppelbindung aus, die unter Lichteinfluss in die cis-Form isomerisieren kann. Die vorliegende Arbeit untersucht die instrumentelle Analytik, den Metabolismus und die Toxizität von ZEN und cis-ZEN.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der quantitativen Analytik von ZEN in Speiseölen. Zuverlässige Analysemethoden sind unabdingbar, da für ZEN in der Europäischen Union (EU) ein Grenzwert von 400 µg/kg in Speiseöl gilt. Ein umfassender Methodenvergleich zeigte, dass dynamisch kovalente Hydrazinchemie (DCHC) eine geeignete Probenvorbereitung ist. Darauf basierend, konnte eine online-Kopplung aus Festphasenextraktion (SPE) und Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie (HPLC) entwickelt werden, die als Neuheit einen kovalenten SPE-Schritt nach dem DCHC Prinzip beinhaltet. Das automatisierte System erlaubt eine richtige, selektive und zuverlässige Bestimmung von ZEN in Speiseölen gemäß EU-Vorgaben, wobei der Arbeitsaufwand wesentlich reduziert ist.
Im Gegensatz zu ZEN fehlen für cis-ZEN Referenzstandards und analytische Methoden, woraus ein Datenmangel bezüglich des Vorkommens, des Abbauverhaltens und der Risiken resultiert. Daher wurden ein nativer und ein isotopenmarkierter cis-ZEN Standard synthetisiert und in eine bestehende Stabilisotopenverdünnungsanalyse HPLC Tandemmassenspektrometrie (HPLC-MS/MS) Methode implementiert. Mittels dieser Methode konnten nach Tageslichtexposition erhebliche Mengen cis-ZEN in ZEN kontaminiertem Speiseöl nachgewiesen werden. Daher sollte cis-ZEN als mögliche Lebensmittelkontaminante in Zukunft bei der Analyse von Lebens- und Futtermitteln Berücksichtigung finden.
Weiterhin wurde der in vitro Phase I Metabolismus von ZEN und cis-ZEN in Ratten- und Humanlebermikrosomen mittels HPLC-MS und HPLC-MS/MS untersucht. Der Phase I Metabolismus von cis-ZEN gleicht im Wesentlichen dem von ZEN. Reduktions- und Oxidationsreaktionen führen zur Bildung von α- und β-cis-Zearalenol (α-/β-cis-ZEL) sowie 13- und 15-OH-cis-ZEN. Als weitere bisher unbekannte Metabolite konnten cis-ZEN-11,12-oxid und ZEN-11,12-oxid aus Inkubationen von Humanlebermikrosomen mit cis-ZEN bzw. ZEN identifiziert werden.
Die Östrogenität von cis-ZEN und seinen reduktiven Metaboliten wurde im E-Screen Assay untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass cis-ZEN minimal östrogener ist als ZEN. Die Umwandlung von cis-ZEN zu β-cis-ZEL entspricht einer Detoxifizierung, während die Metabolisierung von cis-ZEN zu α-cis-ZEL eine metabolische Aktivierung ist, da α-cis-ZEL eine weitaus höhere östrogene Wirkung als cis-ZEN hat. Die katecholischen Metabolite weisen vermutlich eine erheblich geringere Östrogenität als ZEN oder cis-ZEN auf, wie beispielhaft für 15-OH-ZEN gezeigt werden konnte. Unabhängig von den östrogenen Effekten, kann von den katecholischen und epoxidischen Strukturen, die in dieser Arbeit nachgewiesen wurden, ein genotoxisches und karzinogenes Potential erwartet werden. Insbesondere die erstmals als Säugermetabolite beschriebenen Epoxide könnten die bisher vertretene Meinung, dass ZEN ausschließlich als endokriner Disruptor negative Effekte hat, fundamental ändern.
trans-Zearalenone (ZEN) is a non-steroidal estrogenic mycotoxin which frequently contaminates cereal grains worldwide. Ingestion of food and feed containing ZEN causes numerous mycotoxicoses in animals and possibly humans with pronounced estrogenic effects. Due to the trans-configurated double bond, ZEN isomerizes to the cis-configuration upon the influence of light. This work investigates the instrumental analysis, metabolism and toxicity of ZEN and cis-ZEN.
The first part focused on the determination of ZEN in edible oils. Due to a maximum level of 400 µg/kg ZEN in the European Union (EU), reliable analytical methods are needed. A comprehensive method comparison proved dynamic covalent hydrazine chemistry (DCHC) to be the most suitable approach. Thus, an automated solid phase extraction (SPE) coupled online to high performance liquid chromatography (HPLC) was developed with the novelty of a covalent SPE step comprising the DCHC principle. The automated online system allows an accurate, selective and reliable quantification of ZEN in edible oils in compliance with EU performance criteria while significantly reducing workload and thereby personnel costs.
In contrast to ZEN, reference standards and analytical methods are missing for cis-ZEN which causes a lack of data on the occurrence, fate and risks of cis-ZEN. Therefore, a native and an isotopically labeled cis-ZEN standard were synthesized and implemented in an existing stable isotope dilution analysis HPLC tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method. Using this method, a large extent of cis-ZEN formation was observed for ZEN contaminated maize germ oils when exposed to daylight which confirms that cis-ZEN can be a relevant food contaminant and should be considered in the analysis of food and feed.
Furthermore, this work investigated the in vitro phase I metabolism of ZEN and cis-ZEN in rat and human liver microsomes by using HPLC-MS and -MS/MS analyses. The metabolic pathways of cis-ZEN were found to be essentially similar to ZEN including reduction and oxidation reactions generating α- and β-cis-zearalenol as well as 13- and 15-OH-cis-ZEN. A previously unidentified oxidative metabolic pathway for both isomers of ZEN results in the formation of cis-ZEN-11,12-oxide and ZEN-11,12-oxide in human liver microsomes.
The estrogenicity of cis-ZEN and its reductive metabolites was assessed using the E-Screen assay. cis-ZEN proved to be slightly more estrogenic than ZEN. Biotransformation of cis-ZEN to β-cis-ZEL corresponds to a detoxification, whereas metabolism to α-cis-ZEL resembles a metabolic activation as its estrogenicity considerably exceeds that of cis-ZEN. The catecholic metabolites can be expected to show a decreased estrogenicity as demonstrated for 15-OH-ZEN. Independent of the estrogenic effects, the catecholic and epoxidic metabolites identified in this work can be expected to act genotoxic and carcinogenic. The epoxides in particular could fundamentally change the widely accepted view of ZEN causing adverse effects exclusively through endocrine disrupting actions.
