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Development of a bioprocess for heterologous hydrogenase production in Escherichia coli

Fan, Qin

FG Bioverfahrenstechnik

Concerns about exhaustion of natural resources and global warming have led to increasing attention to clean and renewable energy. Here, biohydrogen (H2) is a very attractive alternative because of its various means of production, large energy content per mass and its environmental friendliness. In nature, the most efficient H2 producers are hydrogenases. These metalloenzymes display fascinating redox-chemical properties with tremendous promise as a biocatalyst for H2 production, bioanode in biofuel cells or H2-driven cofactor generation systems. However, the catalytic center of most hydrogenases is irreversibly inactivated by even trace O2 and CO which extremely restricts their biochemical investigations and potential applications. Thus, O2-tolerant hydrogenases that sustain catalytic activity under oxic conditions, particularly from the “Knallgas” bacterium Ralstonia eutropha are promising candidates for biotechnological application. Since understanding of these highly complex enzymes has been severely hampered by low yields, heterologous production of hydrogenases in a robust and genetically tractable expression host is an attractive strategy to make these enzymes more accessible. In the study, the H2-sensing regulatory [NiFe]-hydrogenase (RH) from R. eutropha H16, owing to its relatively simple architecture and extensive use in spectroscopic studies, was chosen as a model for development of a heterologous hydrogenase production system in Escherichia coli. For this purpose, a plasmid-based expression system for the RH structural subunits under control of the IPTG inducible lac-promoter was designed followed by a production screening. Initial trials with fed-batch-like EnPresso B cultivations demonstrated the possibility of heterologous hydrogenase production. Based on the EnPresso growth system, IPTG and lactose autoinduction resulted in a remarkably higher productivity averaged over the whole process time in comparison with classic single-shot IPTG induction. Repeated boosting increased cell densities and soluble RH yield to about 360 mg L-1, an increase of several 100-fold compared to the production in the native organism R. eutropha. Since spectroscopic studies showed the absence of the [NiFe] cofactor, the production process was further improved by investigating different parameters e.g., strain, production temperature and duration, metal additions and co-expression of maturation genes. Hereby, it succeeded in producing a heterologous RH with similar activity to native RH, but with significantly higher yields and shorter process time. Finally, the process was transferred to a high cell density fed-batch cultivation in lab-scale bioreactors, confirming that active RH production of ˃130 mg per liter is possible in pure glucose-based mineral salt medium. This study developed herein lays a good basis for the future production of difficult-to-produce functional hydrogenases for basic and applied science.
Bedenken bezüglich des Verbrauchs natürlicher Ressourcen und der Klimaerwärmung haben zu einer gesteigerten Aufmerksamkeit auf saubere und erneuerbare Energien geführt. Hier ist Biowasserstoff (H2) aufgrund seiner vielfältigen Herstellungsmöglichkeiten, seines hohen Energiegehalts pro Masse und seiner Umweltfreundlichkeit eine sehr attraktive Alternative. In der Nature sind die effizientesten H2-Produzenten die Hydrogenases. Diese Metalloenzyme weisen faszinierende redox chemische Eigenschaften auf und sind vielversprechend als Biokatalysatoren für die H2-Produktion, als Bioanode in Brennstoffzellen oder als Teil H2-betriebener Kofaktorregenerationsysteme. Das katalytische Zentrum der meisten Hydrogenases wird jedoch durch Spuren von O2 and CO irreversibel inaktiviert, was ihre biochemischen Untersuchungen und potenziellen Anwendungen extrem einschrämkt. Daher sind O2-tolerante Hydrogenases, insbesondere aus dem „Knallgas“ Bakterium Ralstonia eutropha, die ihre katalytische Aktivität unter oxischen Bedingungen aufrechterhalten, vielversprechende Kandidaten für die biotechnologische Anwendung. Die Erforschung dieser hochkomplexen Enzyme wird allerdings durch niedrige Ausbeuten stark behindert, weshalb die heterologe Produktion von Hydrogenasen in einem robusten und genetisch gut verstandenen Expressionswirt eine attraktive Strategie darstellt, um diese Enzyme besser herstellen zu können. Aufgrund ihrer relative einfachen Architektur und umfangreichen Verwendung in spektroskopischen Studien wurde in dieser Arbeit, die als H2 Sensor fungierende, regulatorische [NiFe]-Hydrogenase (RH) aus R. eutropha H16 als Model für die Entwicklung eines heterologen Hydrogenase-Produktionssytems in Escherichia coli ausgewählt. Zur diesem Zweck wurde ein plasmidbasiertes Expressionsystem für die Herstellung der RH Strukturuntereinheiten unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren lac Promotors entwickelt, und anschließend verschiedene Produktionsbedingungen evaluiert. Erste Versuche mit „Fed batch like“ EnPresso B Kultiverungen zeigten die Möglichkeit einer heterologen Hydrogenase Produktion. Die Nutzung von IPTG- und Laktose Autoinduktion im EnPresso Wachstumsystems führte im Vergleich zur klassischen Induktion mit einmaliger IPTG-Zugabe zu einer bemerkenswert höheren Produktivität, gemittelt über die gesamte Prozessdauer. Wiederholte Nährstoffzugabe erhöhte die Zelldichte und die lösliche RH-Ausbeute auf ca. 360 mg L-1, was einer 100 fach höheren Produktion im Vergleich zur Herstellung im nativen Organismus R. eutropha entspricht. Da spektroskopische Untersuchungen das Fehlen des [NiFe] Cofaktors zeigten, wurde der Produktionsprozess durch die Untersuchungen verschiedener Parameter, z.B. Stamm, Produktionstemperature und -dauer, Zugabe von Metallionen und Koexpression von Reifungsgenen, weiter verbessert. Auf diese Weise gelang es, eine heterologe RH mit ähnlicher Aktivität wie die native RH herzustellen, jedoch mit deutlich höherer Ausbeute und kürzerer Prozessdauer. Schließlich wurde der Prozess auf eine Hochzelldichte Fed-Batch Kultiverung in Bioreaktoren im Labormaßstab übertragen. Dies bestätigte, dass eine aktive RH Produktion von ˃130 mg pro Liter in reinem Glukose basiertem Mineralsalzmedium möglich ist. Diese Studie bildet eine gute Grundlage für die künftige Produktion von schwierig herzustellenden funktionellen Hydrogenasen für Grundlagen- und angewandten Forschung.