Loading…
Analytical methods and thermodynamic frameworks for efficient biocatalytic nucleoside synthesis via nucleoside phosphorylases
Kaspar, Felix
Nucleosides and nucleoside analogs are indispensable biomolecules which serve as buildings blocks of DNA and RNA, pharmaceuticals and molecular biology tools. Sparked by the demand for synthetic access to these compounds, a variety of approaches for nucleoside synthesis has been developed. Among these, biocatalytic nucleoside synthesis via nucleoside phosphorylases promises a solution to the long-standing selectivity challenges encountered during established chemical approaches. These enzymes enable direct access to nucleosides from their corresponding free nucleobases in a one-pot fashion under mild aqueous conditions. However, the admission of this methodology to the standard repertoire for nucleoside synthesis has been slow, despite the wealth of examples of nucleoside phosphorylase-catalyzed transglycosylations in the literature. This is likely due to a lack of predictability of biocatalytic nucleoside transglycosylations as well as an insufficient arsenal of high-throughput methodologies for the characterization of the respective enzymes and their transformations. To close this gap, this thesis presents analytical methods and thermodynamic frameworks for the characterization and optimization of nucleoside phosphorylase-catalyzed reactions. First, a comprehensive route efficiency assessment of N-glycosylation methods for nucleoside synthesis reveals the bottlenecks of current synthetic approaches and highlights the importance of developing concise and efficient biocatalytic routes. To facilitate this cause, a UV-based high-throughput method for reaction monitoring is described which relies on deconvolution of highly overlapping absorption spectra. With this assay at hand, the equilibrium thermodynamics of nucleoside phosphorolysis were explored systematically, establishing the tight thermodynamic control of this reaction system and providing a range of temperature-dependent equilibrium constants. Building on this foundation, an analytical approach to the monitoring of the hydrolytic decay of UV-inactive pentose-1-phosphates through UV spectroscopy is presented which employs apparent equilibrium shifts via LeChatelier’s principle. Furthermore, the transfer of these thermodynamic principles to transglycosylation reactions provided guidelines and mathematical tools for the yield prediction and optimization in synthetically relevant applications. These were demonstrated via the biocatalytic preparation of synthetically challenging selenium-containing pyrimidine nucleosides in a proof-of-concept study. Lastly, a hyperthermostable enzyme is described which performs phosphorolysis and transglycosylation reactions in cosolvent-heavy and near-boiling media, enabling increased substrate loading compared to common nucleoside transglycosylations. Collectively, the results and thermodynamic insights disclosed in this thesis enable the prediction and optimization of yields in nucleoside phosphorolysis and transglycosylation reactions, paving the way for efficient nucleoside synthesis via biocatalytic one-pot processes.
Nukleoside und Nukleosidanaloga sind wichtige Biomoleküle, die als Bausteine von DNA und RNA, Pharmazeutika und molekularbiologische Werkzeuge dienen. Der breite Bedarf an diesen Molekülen hat die Entwicklung einer Vielzahl von synthetischen Ansätzen angetrieben. Unter diesen ist die biokatalytische Nukleosidsynthese durch Nukleosidphosphorylasen besonders vielversprechend, da diese eine Lösung für die bestehenden Selektivitätsprobleme etablierter chemischer Methoden bietet. Diese Enzyme ermöglichen direkten synthetischen Zugang zu Nukleosiden, ausgehend von den zugehörigen freien Nukleobasen unter milden wässrigen Bedingungen. Trotz der wachsenden Zahl an Literaturbeispielen für Transglykosylierungsreaktionen mit Nukleosidphosphorylasen, geschieht die Aufnahme dieser Methodik in das Standardrepertoire für Nukleosidsynthesen jedoch nur sehr langsam. Dies begründet sich wahrscheinlich in der mangelnden Vorhersehbarkeit der Ausbeuten in biokatalytischen Transglykosylierungen, sowie dem limitierten Arsenal an Hochdurchsatzmethoden zur Charakterisierung der entsprechenden Enzyme und ihrer Reaktionen. Um diese Lücke zu schließen, präsentiert diese Arbeit analytische Methoden und einen thermodynamischen Rahmen zur Charakterisierung und Optimierung von Nukleosidphosphorylasekatalysierten Reaktionen. Zunächst werden Engpässe und Limitationen von bekannten Methoden zur Nukleosidsynthese mittels einer Effizienzanalyse beleuchtet, was die Notwendigkeit der Entwicklung von effizienten biokatalytischen Ansätzen aufzeigt. Um dieses Unterfangen zu ermöglichen, wird darauffolgend eine UV-basierte Hochdurchsatzmethode zum Reaktionsmonitoring von Nukleosidphosphorolyse-Reaktionen präsentiert, die auf Dekonvolution von stark überlappenden Absorptionsspektren beruht. Mittels dieser Methode wurde die Gleichgewichtsthermodynamik von Nukleosidphosphorolyse-Reaktionen untersucht, wodurch die thermodynamische Reaktionskontrolle in diesem System etabliert werden konnte. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde ferner ein analytischer Ansatz zur UV-spektroskopischen Beobachtung der Hydrolyse von UV-inaktiven Pentose-1-phosphaten entwickelt, welcher sich Gleichgewichtsverschiebungen nach dem Prinzip von LeChatelier bedient. Der Transfer dieser thermodynamischen Erkenntnisse auf Nukleosidtransglykosylierungen ergab Richtlinien und mathematische Werkzeuge zur Vorhersage und Optimierung der Ausbeuten in diesen synthetisch relevanten Reaktionen. Diese wurden anschließend anhand der Präparation von synthetisch anspruchsvollen Selen-modifizierten Pyrimidinnukleosiden in einer Proof-of-concept Studie demonstriert. Zuletzt wird eine hyperthermostabile Nukleosidphosphorylase beschrieben, welche in Kosolvens-lastigen und fast kochenden Medien stabil und katalytisch aktiv ist, wodurch eine höhere Substratlöslichkeit verglichen mit gängigen Nukleosidtransglykosylierungen ermöglicht wird. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse dieser Arbeit die Vorhersage und Optimierung von Ausbeuten in Nukleosidphosphorolyse und -transglykosylierungen, was die effiziente Synthese von Nukleosiden in biokatalytischen Eintopfreaktionen ermöglicht.
