Neue Wirkstoffe gegen Pankreaskrebs aus der Ostsee-Braunalge Fucus vesiculosus: Etablierung eines Aufreinigungsschemas nach dem Prinzip der Aktivitäts-geleiteten Fraktionierung
| dc.contributor.advisor | Kalthoff, Holger | |
| dc.contributor.advisor | Piker, Levent | |
| dc.contributor.author | Zenthoefer, Marion | |
| dc.contributor.grantor | Technische Universität Berlin | en |
| dc.contributor.referee | Lauster, Roland | |
| dc.contributor.referee | Kalthoff, Holger | |
| dc.contributor.referee | Rappsilber, Juri | |
| dc.date.accepted | 2021-02-23 | |
| dc.date.accessioned | 2021-07-02T15:11:39Z | |
| dc.date.available | 2021-07-02T15:11:39Z | |
| dc.date.issued | 2021 | |
| dc.description.abstract | Braunalgen werden seit dem Altertum in der Phytotherapie eingesetzt [Hoppe et al. 1979; Liu et al. 2012]. In neuerer Zeit ist von vielfältigen medizinischen Wirkungen dieser Algengruppe und ihrer isolierten Substanzen berichtet worden. Diese umfassen auch Wirkungen gegen Krebs [Gupta und Abu-Ghannam 2011]. Die Ostsee ist mit ihrem geringen Salzgehalt und den fehlenden Gezeiten ein besonderes Habitat für marine Algen [Rheinheimer 1996]. Über das Potential der dort am weitesten verbreiteten und auffälligsten Braunalge, dem Blasentang (Fucus vesiculosus L.) [Kautsky et al. 1992], für Wirkungen gegen Krebs war bisher jedoch nichts bekannt. Mit der vorliegenden Arbeit als Teil des Verbundprojekts „Algae against Cancer (AAC)“ sollte diese Wissenslücke geschlossen werden. Das AAC-Projekt, das von 2010 bis 2013 vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert worden ist, widmete sich in einem seiner zwei Projektteile der Aufklärung des Anti-Krebs-Potentials des aus der Ostsee stammenden F. vesiculosus [Zenthoefer et al. 2017]. Auch die zugrundeliegenden zellulären Mechanismen der Wirkung, die ein nachweislich aktiver Extrakt dieser Alge in Pankreaskrebszellen induzierte, wurden in diesem Projektteil beleuchtet [Geisen et al. 2015]. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren im Einzelnen die systematische Analyse der zytotoxischen Aktivität des F. vesiculosus aus der Ostsee gegenüber den zwei duktalen Pankreasadenokarzinom-Zelllinien Panc89 und PancTU1 sowie die Entwicklung und Etablierung eines Extraktions- und Aufreinigungsschemas für eine aufgefundene Aktivität. Die Analysen wurden entsprechend des Ansatzes der Aktivitäts-geleiteten Fraktionierung (bioassay-guided fractionation) durchgeführt, bei dem alle initialen Rohextrakte und sukzessive produzierten Fraktionen in einem 72-stündigen Viabilitätsassay (XTT-Assay) auf ihre Aktivität und per 1H-NMR-Spektroskopie auf ihre Inhaltsstoffe hin untersucht worden sind. Aus frisch-gefrorenem Algenmaterial, das im späten Frühjahr aus der Kieler Förde in der westlichen Ostsee gesammelt worden ist, wurden sechs verschiedene Rohextrakte angefertigt. Vier dieser sechs Rohextrakte zeigten deutliche zytotoxische Aktivität gegenüber der Zelllinie Panc89, drei davon gegenüber der Zelllinie PancTU1. Der aktivste Rohextrakt, FvT_A, der vom zentralen Thallusmaterial der Alge unter Einsatz von Aceton in einem Verhältnis von 1:2 (w/v) angefertigt wurde, zeigte im Standard-XTT-Assay eine mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) von 72 bzw. 77 μg/ml gegenüber den Panc89- bzw. PancTU1-Zellen. Für FvT_A wurde ein mehrstufiges Fraktionierungs- und Auf-reinigungsschema implementiert, das, hintereinandergeschaltet, die Prozesse Präzipitation, Normalphase-Chromatographie an Pharmprep60CC SiO2-Material und Umkehrphase-Chromatographie an Amberlite® XAD7HP-Material beinhaltet. Dieses Aufreinigungsschema führte, ausgehend vom Rohextrakt bis hin zu den aktivsten Fraktionen, F15/F16, zu einer rund vierfachen Reduktion des IC50-Werts. Die vergleichende Auswertung aller 1H-NMR-Spektren ergab einen charakteristischen “Fingerabdruck” (fingerprint), der signifikant mit der Viabilitäts-inhibierenden Aktivität korrelierte. Aus den Ergebnissen erster Strukturanalysen mit Hilfe verschiedener NMR-Spektroskopie-Methoden sowie IR- und UV-Spektroskopie wurde geschlossen, dass es sich bei den aktiven Substanzen in F15/F16 um zwei ähnliche Moleküle mit Molekulargewichten von 1331 (±5 %) und 1173 (±5 %) g/mol handelt, die zur Gruppe der Polyphenole gehören und höchstwahrscheinlich Phlorotannine sind. Eine weitere Auftrennung von F15/F16 und weitere Strukturanalysen sind jedoch notwendig, um die Struktur im Detail aufzuklären. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die Braunalge F. vesiculosus aus der Ostsee potentielle Wirkstoffe gegen Pankreaskrebs enthält. Die Ergebnisse sind vielversprechend, da sie nicht nur technisch, sondern auch biologisch reproduzierbar sind und da die aktiven Substanzen offenbar noch nicht bekannt sind. | de |
| dc.description.abstract | Brown seaweeds have been used in phytotherapy since ancient times [Hoppe et al. 1979; Liu et al. 2012]. In recent years, a multitude of medical effects have been reported for this group of algae and for their isolated substances that also cover anti-tumor activities [Gupta and Abu-Ghannam 2011]. Though being the most common and most conspicuous brown seaweed species in the Baltic Sea [Kautsky et al. 1992], nothing was known, so far, about the anti-cancer potential of the Bladderwrack, Fucus vesiculosus L., grown in this particular habitat with low salinity and non-tidal shores [Rheinheimer 1996]. With the present work which was part of the national research project “Algae against Cancer (AAC)” this knowledge gap should be closed. The AAC-project, funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF) from 2010 to 2013, was in one of its two parts dedicated to the examination of the anti-cancer potential of the Baltic Sea F. vesiculosus [Zenthoefer et al. 2017] followed by the elucidation of the cellular mechanisms of the anti-cancer effect that one verifiably active F. vesiculosus extract induced in pancreatic cancer cell lines [Geisen et al. 2015]. In detail, the objectives of the present work were to provide a systematic analysis of the cytotoxic activity of F. vesiculosus against the two pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines Panc89 and PancTU1 and for a detected anti-cancer activity, a tailor-made extraction and purification procedure should be developed and implemented. To come closer to these objectives, a bioassay-guided fractionation approach was used in which all initial crude extracts and successively produced fractions were examined for their activity in a 72 h viability assay (XTT assay) and monitored for their ingredients using 1H-NMR spectroscopy. Six different crude extracts were prepared from freshly frozen algae material collected from the Kiel Fjord, Western Baltic Sea, at late springtime. Four out of these six crude extracts showed considerable cytotoxic activity against the Panc89 cells and three out of them were active against the PancTU1 cells. The most active crude extract, FvT_A, prepared from central parts of the thallus of the alga by the use of acetone at the rate of 1:2 (w/v) revealed a half maximal effective concentration (IC50) of 72 and 77 μg/ml, respectively, against the Panc89 and PancTU1 cells in the standard XTT assay. For FvT_A, a multistep fractionation and purification procedure was implemented consisting of the processes precipitation, normal-phase chromatography on a Pharmprep60CC SiO2 and reversed-phase chromatography on Amberlite® XAD7HP. This purification scheme resulted in a fourfold reduction of the IC50 from the crude extract to the most active fractions F15/F16. Evaluation of all 1H-NMR spectra revealed a characteristic fingerprint which significantly correlated with the anti-cancer activity. Structural analysis using different methods of NMR spectroscopy as well as IR and UV spectroscopy revealed for the active compounds in F15/F16 two similar molecules with a molecular weight of 1331 (±5 %) and 1173 (±5 %) g/mol which belong to the group of polyphenols and are most probably phlorotannins. However, further separation of F15/F16 and further structural analysis is needed in order to present the chemical structure in all details. In summary, the results show that F. vesiculosus from the Baltic Sea holds potent anti-cancer substances. The findings are promising as they are not only technically but also biologically reproducible and the isolated active substances seem to be as yet unknown. | en |
| dc.description.sponsorship | BMBF, 0315812C, KMU-innovativ-5: Algae Against Cancer (AAC) - Antitumorale Makroalgenextrakte: Spezifizierung von Wirkstoffen und Wirkmechanismen | en |
| dc.identifier.uri | https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/12870 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-11670 | |
| dc.language.iso | de | en |
| dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ | en |
| dc.subject.ddc | 610 Medizin und Gesundheit | de |
| dc.subject.other | Pankreaskrebs | de |
| dc.subject.other | Fucus vesiculosus | de |
| dc.subject.other | Braunalge | de |
| dc.subject.other | Ostsee | de |
| dc.subject.other | Aktivitäts-geleitete Fraktionierung | de |
| dc.subject.other | pancreatic cancer | en |
| dc.subject.other | bladder wrack | en |
| dc.subject.other | brown seaweed | en |
| dc.subject.other | Baltic Sea | en |
| dc.subject.other | bioassay-guided fractionation | en |
| dc.title | Neue Wirkstoffe gegen Pankreaskrebs aus der Ostsee-Braunalge Fucus vesiculosus: Etablierung eines Aufreinigungsschemas nach dem Prinzip der Aktivitäts-geleiteten Fraktionierung | de |
| dc.title.translated | New active ingredients against pancreatic cancer from the Baltic brown seaweed Fucus vesiculosus: Establishment of a purification scheme based on the principle of bioassay-guided fractionation | en |
| dc.type | Doctoral Thesis | en |
| dc.type.version | acceptedVersion | en |
| tub.accessrights.dnb | free | en |
| tub.affiliation | Fak. 3 Prozesswissenschaften::Inst. Biotechnologie::FG Medizinische Biotechnologie | de |
| tub.affiliation.faculty | Fak. 3 Prozesswissenschaften | de |
| tub.affiliation.group | FG Medizinische Biotechnologie | de |
| tub.affiliation.institute | Inst. Biotechnologie | de |
| tub.publisher.universityorinstitution | Technische Universität Berlin | en |