Charakterisierung eines Zellkultur-adaptierten Hepatitis-E-Virus-Stammes aus einem chronisch infizierten Patienten mittels Reverser Genetik
| dc.contributor.advisor | Kurreck, Jens | |
| dc.contributor.advisor | Johne, Reimar | |
| dc.contributor.author | Scholz, Johannes | |
| dc.contributor.grantor | Technische Universität Berlin | en |
| dc.contributor.referee | Kurreck, Jens | |
| dc.contributor.referee | Johne, Reimar | |
| dc.contributor.referee | Bock, Claus-Thomas | |
| dc.date.accepted | 2021-07-29 | |
| dc.date.accessioned | 2021-09-09T12:32:04Z | |
| dc.date.available | 2021-09-09T12:32:04Z | |
| dc.date.issued | 2021 | |
| dc.description.abstract | Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist ein weltweit verbreitetes Virus, welches eine akute oder chronische Leberentzündung hervorrufen kann. Das ikosaedrische, sowohl unbehüllt als auch quasi-behüllt vorkommende Viruspartikel besitzt ein gecapptes, polyadenyliertes Plusstrang-RNA-Genom mit einer Länge von ca. 7.2 kb, das für drei offene Leserahmen (ORF1-3) kodiert. Insgesamt existieren acht Genotypen (GT) mit zahlreichen Subtypen, von denen GT 1-4 und GT7 humanpathogen sind. In Deutschland kommt hauptsächlich GT3 mit den Subtypen 3c, 3e und 3f vor. Dieser Genotyp ist in Wild- und Hausschweinen weit verbreitet und wird von diesen Tieren aus, meistens über den Verzehr unzureichend erhitzter Fleischprodukte, zoonotisch auf den Menschen übertragen. Infektionen von Transplantationspatienten mit GT3 resultieren oft in einer chronischen Hepatitis, die häufig zu einer lebensbedrohlichen Leberzirrhose führt. Die Forschung an HEV wird derzeit dadurch erschwert, dass nur wenige robuste Reverse Genetische Systeme (RGS) existieren, mit denen gezielte Veränderungen in das HEV-Genom eingebracht werden können, um die Funktion von Virusproteinen und Genomregionen aufzuklären. Erstmals sollte deshalb in dieser Arbeit für den in Europa vorherrschenden HEV-Subtyp 3c ein RGS etabliert werden. Hierfür sollte der Stamm 47832c verwendet werden, der ursprünglich aus einem chronisch infizierten Patienten aus Deutschland isoliert wurde. Dieser Stamm besitzt wie einige andere HEV-Stämme aus chronisch infizierten Patienten auch eine spezifische Insertion im ORF1, welche für das effiziente Wachstum in der Zellkultur nötig zu sein scheint. Nach der Entwicklung des RGS sollte das System deshalb unter anderem zur Untersuchung dieser Insertion eingesetzt werden. Im Ergebnis konnte ein neuartiges und robustes RGS entwickelt werden, das im Gegensatz zu vorherigen Systemen auf den aufwendigen in vitro-RNA-Synthese-Schritt verzichten kann. T7 Polymerase-exprimierende BSR-T7/5-Zellen wurden dazu mit dem genomischen cDNA-Plasmid und zwei Capping-Helferplasmiden co-transfiziert. Die entstandenen infektiösen Viren wurden anschließend auf hochempfänglichen A549/D3-Zellen passagiert. Die dadurch hergestellten Viren wurden mittels Immunfluoreszenz, RT-qPCR und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert und zeigten ähnliche Eigenschaften wie der ursprüngliche Stamm 47832c. Eine stille Punktmutation, die eine zusätzliche Restriktionsschnittstelle erzeugte, wurde erfolgreich in das HEV-Genom eingefügt. Durch Deletion und Substitution der spezifischen Insertion im ORF1 konnte gezeigt werden, dass deren Aminosäure-Sequenz, nicht aber die Nukleotidsequenz, eine entscheidende Rolle bei der Erhöhung der HEV-Replikationseffizienz in der Zellkultur spielt. Die Einfügung einer Glycin-zu-Arginin-Mutation, die bei einem anderen HEV-Stamm das Wachstum erhöhte, führte im Stamm 47832c zu keinem replikationsfördernden Effekt. Eine ORF3-Deletionsmutante zeigte eine drastische Abnahme der Replikationsfähigkeit, was auf eine wichtige Bedeutung des ORF3-Produkts hinweist. Zusammenfassend ist die Entwicklung eines robusten RGS für einen HEV-Subtyp 3c-Stamm erfolgreich gewesen. Erste Anwendungen zeigen, dass sich mit dem System die Funktionen von Genomregionen und Virusproteinen von HEV untersuchen lassen. Zukünftige Studien sollten die funktionellen Bereiche in der Genom-Insertion des Stammes 47832c und im ORF3 weiter eingrenzen, um die jeweiligen Wirkmechanismen aufzuklären. Ob die beobachteten Unterschiede auf eine Virusstamm- oder Zelltyp-Spezifität zurückzuführen sind, sollte mittels Austauschen der Genom-Insertionen und spezifischen Punktmutationen zwischen verschiedenen HEV-Stämmen sowie durch Versuche mit unterschiedlichen Zellkulturen aufgeklärt werden. Darüber hinaus sollte das RGS zukünftig weiter optimiert werden, um eine schnellere und effizientere Verwendung dieses Systems in der Anwendungs- und Grundlagen-orientierten HEV-Forschung zu ermöglichen. | de |
| dc.description.abstract | The hepatitis E virus (HEV) is a worldwide distributed virus, which can cause acute and chronic liver inflammations. The icosahedral, non-enveloped or quasi-enveloped particle carries a capped and poly-adenylated single-stranded (+)-RNA genome, approximately 7.2 kb in length, coding for three open reading frames (ORF1-3). HEV consists of eight genotypes (GT) with many subtypes, of which GT 1-4 and GT 7 are human-pathogenic. In Germany, genotype 3, with the subtypes 3c, 3e and 3f, is predominant. This genotype is prevalent in wild boars and domestic pigs and mostly zoonotically transmitted by consumption of undercook meat and meat products. Infections of organ transplantation recipients with GT3 often lead to chronic hepatitis with life-threatening liver cirrhosis. Research on HEV is currently limited because only a few robust Reverse Genetics Systems (RGS) exist, which can be used to introduce targeted changes into the HEV genome in order to unravel the function of viral proteins and genome regions. Therefore, a RGS for the HEV subtype 3c, which is predominant in Europe, should be established for the first time in this project. The HEV strain 47832c, which was originally isolated from a chronically infected patient from Germany, should be used for the system. As also known for some other HEV strains from chronically infected patients, this strain carries a specific insertion within its ORF1, which is suspected to be essential for efficient cell culture growth. Therefore, after the development of the RGS, the system should be also used to analyze this insertion. As a result, a novel and robust RGS could be established here, which – in contrast to former systems – does not need a laborious in-vitro RNA synthesis step. T7 polymerase-expressing BSR T7/5 cells were co-transfected with the genomic cDNA plasmid together with two capping helper plasmids. The resulting infectious viruses were subsequently passaged on highly susceptible A549/D3 cells. The generated viruses were characterized using immunofluorescence, RT-qPCR and transmission electron microscopy showing similar properties like the original strain 47832c. A silent point mutation, which led to an additional restriction enzyme cutting site, was successfully inserted into the HEV genome. Using deletions and substitutions of the specific insertion in ORF1 it was shown, that its amino acid sequence, but not the nucleotide sequence, is crucial for the increase of viral replication efficiency in cell culture. The introduction of a glycine-to-arginine mutation, which causes increasing viral cell culture growth in another HEV strain, did not lead to a significant growth advantage for strain 47832c. An ORF3 deletion mutant showed a dramatic decrease in cell culture replication, indicating an important role of the ORF3 product. It can be summarized that the establishment of a robust RGS for an HEV subtype 3c strain was successful. First applications show, that this system can be used to study the function of genome regions and viral proteins of HEV. Future studies should focus on the functional regions of the genome insertion of strain 47832c and its ORF3 in order to unravel the distinct mechanisms of action. In order to decide if the observed differences are caused by virus strain specificity or cell type specificity, exchanges of genome regions and specific point mutations between strain 47832c and other strains, as well as testing of other cell lines should be done. In addition, the RGS should to be further optimized in future in order to enable its faster and more efficient use in basic and applied HEV research. | en |
| dc.identifier.uri | https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/13463 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-12249 | |
| dc.language.iso | de | en |
| dc.rights.uri | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | en |
| dc.subject.ddc | 570 Biowissenschaften; Biologie | de |
| dc.subject.other | Hepatitis-E-Virus | de |
| dc.subject.other | reverse Genetik | de |
| dc.subject.other | Zellkultur | de |
| dc.subject.other | Mutagenese | de |
| dc.subject.other | hepatits E virus | en |
| dc.subject.other | reverse genetics | en |
| dc.subject.other | cell culture | en |
| dc.subject.other | mutagenesis | en |
| dc.title | Charakterisierung eines Zellkultur-adaptierten Hepatitis-E-Virus-Stammes aus einem chronisch infizierten Patienten mittels Reverser Genetik | de |
| dc.title.translated | Characterization of a cell culture adapted hepatitis E virus strain from a chronic infected patient using reveres genetics | en |
| dc.type | Doctoral Thesis | en |
| dc.type.version | acceptedVersion | en |
| tub.accessrights.dnb | free | en |
| tub.affiliation | Fak. 3 Prozesswissenschaften::Inst. Biotechnologie | de |
| tub.affiliation.faculty | Fak. 3 Prozesswissenschaften | de |
| tub.affiliation.institute | Inst. Biotechnologie | de |
| tub.publisher.universityorinstitution | Technische Universität Berlin | en |