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Understanding proton transfer in phytochromes

González Medina, Ronald

FG Modellierung biomolekularer Systeme

Phytochromes have an interesting ability to photoconvert between red-absorbing (Pr) and far-red-absorbing (Pfr) states. However, this photoconversion process depends on key interactions between a bilin chromophore and protein matrix, thus, the identification of the chemical nature and quantification of chromophore-protein interactions constitute an essential step for understanding the photoconversion process, as well as the proton transfer events taking place during the photocycle. In this work, we presented a powerful and straightforward approach based on the fragment molecular orbital (FMO) method to identify the nature and quantify the strength of the noncovalent interactions at a fully quantum mechanical level between the biliverdin (BV) chromophore and protein of the Deinococcus radiodurans phytochrome (DrBphP) in the Pr state. One of the most interesting features of the FMO method is the pair interaction energy decomposition analysis (PIEDA) approach, the application of PIEDA led to the identification of the pyrrole water, Asp207, and Glu27 as key residues for the stabilization of the pyrrole rings of the BV chromophore through the formation of six H-bonds. Furthermore, the conserved Arg254 and His260 were also identified as essential residues in the conformational stability of both propionic side chains B and C. Interestingly, new interactions were identified in the chromophore-binding pocket, two nonclassical H-bonds (CH/O interactions) between Asp207 and Tyr263, and an OH/π interaction between Tyr263 and ring D of the BV chromophore, which might have photochemical relevance. Since the photoconversion reaction of phytochromes is achieved in part by protonation state changes of the chromophore and key residues of the protein matrix. The accurate determination of the protonation states of the chromophore and titratable amino acids constitutes an essential step in order to understand the proton transfer process between the BV and protein matrix. To this end, two different approaches were applied to the Agp2 phytochrome in the Pfr and Meta-F states. The first approach is based on the combination of electrostatic energy computations by solving the Poisson Boltzmann equation (PBE) with classical molecular dynamics (MD) simulations. The second one is the constant pH molecular dynamics (CpHMD) method, which has been used for studying several important biological processes caused by changes in solution pH. One of the main advantages of the CpHMD approaches is that the protonation states may change during the conformational dynamics. Thus, the dynamical processes coupled to a change in protonation states can be directly studied. The results obtained with the first approach led to a propionic side chain of ring C deprotonated in both Pfr and Meta-F states. However, these results are in contradiction with the experimental Raman spectra of Agp2 phytochrome. In contrast, the application of the CpHMD method to the Agp2 phytochrome led to a propionic side chain of ring C protonated in both Pfr and Meta-F states as well as the identification of the His278 as a potential proton site acceptor. Thus, the pKa values obtained with the CpHMD method are in good agreement with the experimental results. Furthermore, this approach identified the His278 as a potential proton site acceptor, since the protonation state of pscC and His278 are highly correlated. In summary, by using the CpHMD approach, the dynamical processes coupled to a change in protonation states of phytochromes structures can be directly studied, whilst, by using classical MD simulations, the protonation states are fixed during the conformational dynamic, which leads to an unrealistic sampling. Interestingly, the conclusions derived for the Agp2 phytochrome can be extended to all bathy phytochromes, since the residues located in the chromophore binding pocket are highly conserved, furthermore, these results, not only reveal the role of His278 in the photocycle but also the importance of carrying out a better sampling of the His residues that are in direct contact with the chromophore molecule.
Phytochrome haben die interessante Fähigkeit, zwischen rot-absorbierenden (Pr) und fern-rotabsorbierenden (Pfr) Zuständen zu photokonvertieren. Dieser Photokonversionsprozess hängt jedoch von Schlüsselinteraktionen zwischen einem Bilin-Chromophor und der Proteinmatrix ab. Daher ist die Identifizierung der chemischen Natur und die Quantifizierung der Chromophor-Protein Interaktionen ein wesentlicher Schritt zum Verständnis des Photokonversionsprozesses sowie der Protonentransfer-Ereignisse, die während des Photozyklus stattfinden. In dieser Arbeit präsentierten wir einen leistungsstarken und einfachen Ansatz, der auf der Fragment-Molekularorbital-Methode (FMO) basiert, um die Natur und die Stärke der nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen dem Biliverdin (BV)-Chromophor und dem Protein des Deinococcus radiodurans Phytochroms (DrBphP) im Pr-Zustand zu identifizieren und zu quantifizieren. Eine der interessantesten Eigenschaften der FMO-Methode ist der Ansatz der “pair interaction energy decomposition analysis” (PIEDA). Die Anwendung von PIEDA führte zur Identifizierung des Pyrrolwassers, Asp207 und Glu27 als Schlüsselreste für die Stabilisierung der Pyrrolringe des BV Chromophors durch die Bildung von sechs H-Bindungen. Darüber hinaus wurden die konservierten Arg254 und His260 als essentielle Reste für die Konformationsstabilität der beiden Propionseitenketten B und C identifiziert. Interessanterweise wurden neue Wechselwirkungen in der Chromophor-Bindungstasche identifiziert, zwei nicht-klassische H-Bindungen (CH/O Wechselwirkungen) zwischen Asp207 und Tyr263 sowie eine OH/π-Wechselwirkung zwischen Tyr263 und Ring D des BV-Chromophors, die photochemische Relevanz haben könnten. Denn die Photokonversionsreaktion von Phytochromen wird zum Teil durch Protonierungszustandsänderungen des Chromophors und von Schlüsselresten der Proteinmatrix erreicht. Die genaue Bestimmung der Protonierungszustände des Chromophors und der titrierbaren Aminosäuren ist ein wesentlicher Schritt, um den Protonentransferprozess zwischen BV und Proteinmatrix zu verstehen. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene Ansätze auf das Phytochrom Agp2 im Pfr- und Meta-F-Zustand angewendet. Der erste Ansatz basiert auf der Kombination von elektrostatischen Energieberechnungen durch Lösung der Poisson-Boltzmann-Gleichung (PBE) mit klassischen Molekulardynamik (MD)-Simulationen. Der zweite ist die Methode der konstanten pH Molekulardynamik (CpHMD), die für die Untersuchung mehrerer wichtiger biologischer Prozesse verwendet wurde, die durch Änderungen des Lösungs-pH verursacht werden. Einer der Hauptvorteile der CpHMD-Ansätze ist, dass sich die Protonierungszustände während der Konformationsdynamik ändern können. Somit können die dynamischen Prozesse, die mit einer Änderung der Protonierungszustände gekoppelt sind, direkt untersucht werden. Die mit dem ersten Ansatz erhaltenen Ergebnisse führten dazu, dass die Propionssäureseitenkette von Ring C sowohl im Pfr- als auch im Meta-F-Zustand deprotoniert ist. Diese Ergebnisse stehen jedoch im Widerspruch zu den experimentellen Raman-Spektren vom Agp2 Phytochrom. Im Gegensatz dazu führte die Anwendung der CpHMD-Methode auf das Agp2-Phytochrom zu einer sowohl im Pfr- als auch im Meta-F-Zustand protonierten Propionsäureseitenkette des Rings C sowie zur Identifizierung des His278 als potentieller Protonenakzeptor. Die mit der CpHMD-Methode erhaltenen pKa-Werte stehen somit in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen. Darüber hinaus identifizierte dieser Ansatz das His278 als potentiellen Protonenakzeptor, da der Protonierungszustand von pscC und His278 hoch korreliert sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Verwendung des CpHMD-Ansatzes die dynamischen Prozesse, die mit einer Änderung der Protonierungszustände von Phytochromstrukturen gekoppelt sind, direkt untersucht werden können, während bei der Verwendung klassischer MD-Simulationen die Protonierungszustände während der Konformationsdynamik fixiert sind, was zu einem unrealistischen Sampling führt. Interessanterweise können die für das Agp2-Phytochrom abgeleiteten Schlussfolgerungen auf alle Bathy-Phytochrome ausgedehnt werden, da die in der Chromophor-Bindungstasche befindlichen Reste hoch konserviert sind. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse nicht nur die Rolle von His278 im Photozyklus, sondern auch die Wichtigkeit der Durchführung eines besseren Samplings der His-Reste, die in direktem Kontakt mit dem Chromophor-Molekül stehen.