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Understanding the chitin synthases repertoire of the filamentous fungus Aspergillus niger

Barthel, Lars

The filamentous fungus Aspergillus niger is the foundation of modern biotechnology and is still of great economic importance, especially with regards to the production of organic acids and proteins. Its tube shaped and branched multicellular segments called hyphae are protected by a strong and flexible outer layer - the cell wall. This dynamic structure mainly consists of heavily intertwined and linked polymers, including glucans and chitin, in addition to various other polymers and mannoproteins. Chitin forms the inner layer of the cell wall and mediates structural stiffness to the organism. Its synthesis is catalysed by enzymes called chitin synthases. This study aims at characterising the nine predicted chitin synthase encoding genes in A. niger and assigning each individual biological functions, in addition to testing the hypothesis that a knock-out of these genes can result in increased protein secretion. To achieve this, numerous bioinformatical investigations were conducted with all nine genes, including the analysis of conserved protein domains, the comparison of transcriptional activity, co-expression network analysis, and the creation of a phylogenetic tree. Furthermore, ten A. niger chitin synthase knock-out strains were constructed using split marker or CRISPR/Cas9 approaches, which ultimately generated nine single knock-out strains and a single isolate combining two chitin synthase deletions. This strain library was experimentally examined with a large variety of techniques. Morphological differences in hyphal growth, colony growth and sporulation were quantified, along with differences in 3D pellet morphology enlightened by cutting-edge µCT technology. Additionally, the cell wall composition was evaluated and the response to multiple cell wall stress agents was tested. Furthermore, shake flask and stirred tank bioreactor cultivations were performed and protein concentrations in supernatant were evaluated. Whole genome sequencing was conducted with all generated strains and the transcriptome of selected mutants was examined to facilitate differential gene expression analysis. Based on the observed results and a broad literature research, specific non-redundant biological functions during the life cycle of A. niger were assigned to all chitin synthases. Furthermore, significantly increased protein concentrations were present in the culture supernatant of multiple knock-out strains. The mutant A. niger LB9.1, deleted in chsF, stood out particularly, showing an up to 300% increased protein level. The differential gene expression analysis unveiled two so for uncharacterised transcription factors (ORF codes: ATCC64974_43570 and ATCC64974_22400) most likely involved in the fungal morphological development. Additionally, a potential secondary metabolite cluster including the polyketide synthase encoded by ATCC64974_109730 was found to be approximately 100-fold upregulated in consequence of the deletion of csmA. Furthermore, genes involved in glucan synthesis and remodelling as well as chitin degradation were found to be differentially expressed to compensate the loss-of -function. In summary, both initial aims of this study have been achieved. Additionally, unexpected discoveries including the prediction of morphology-relevant transcription factors and the upregulation of a secondary metabolite cluster were made. Finally, the first ever high throughput comparative synchrotron µCT experiment unveiled the 3D structure of fungal pellets, thus providing proof of principle for high-throughput applications of this method. The fundamental knowledge gained on the complex regulatory network controlling chitin biosynthesis and consequently growth and development in A. niger has great potential to contribute to current and upcoming global challenges including human health, food supply, and an overall sustainable and environmentally friendly economy.
Der filamentöse Pilz Aspergillus niger ist die Grundlage der modernen Biotechnologie und ist nach wie vor von großer wirtschaftlicher Bedeutung, insbesondere im Hinblick auf die Produktion organischer Säuren und Proteine. Seine röhrenförmigen, verzweigten mehrzelligen Segmente, genannt Hyphen, werden durch eine starke und flexible Außenschicht – die Zellwand – geschützt. Diese Struktur besteht aus verflochtenen und verknüpften Polymeren wie Glucanen und Chitin sowie Mannoproteinen. Chitin bildet die innerste Schicht der Zellwand und sorgt für die strukturelle Festigkeit. Seine Synthese wird durch Enzyme der Gruppe der Chitinsynthasen katalysiert. Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung sowie die Zuordnung individueller biologischer Funktionen für alle neun in A. niger vorhergesagten Chitinsynthasen. Zusätzlich soll die Hypothese getestet werden, dass ein Knock-out der Chitinsynthase codierenden Gene die Proteinsekretion steigern kann. Hierfür wurden die neun Gene zahlreichen bioinformatischen Untersuchungen wie der Analyse konservierter Proteindomänen, dem Vergleich der Expressionsstärke, Analysen der Co-Expressionsnetzwerke und der Zuordnung in einem phylogenetischen Baum unterzogen. Außerdem wurden zehn A. niger Chitinsynthase Knock-out Stämme (9 Einfach-Knock-outs und ein Doppel -Knock-out) mittels Split-Marker oder CRISPR/Cas9 Techniken erstellt. Diese Stammsammlung wurde auf verschiedene Arten experimentell untersucht. Morphologische Unterschiede des Hyphen- und Koloniewachstums sowieso der Sporulation wurden quantifiziert. Außerdem wurde die 3D Pelletstruktur durch modernste μCT-Technologie aufgeklärt. Die Zellwandzusammensetzung wurde analysiert und die Reaktion der Stämme auf verschiedene Stressoren getestet. Des Weiteren wurden Schüttelkolben-, sowie Bioreaktorkultivierungen durchgeführt und die Gesamtproteinmenge im Kulturüberstand bestimmt. Das Genom aller Stämme wurde vollständig sequenziert. Das Transkriptom sowie darauf basierend die differenzielle Genexpression wurde in ausgewählten Stämmen analysiert. Auf Basis dieser Untersuchungen und einer breit angelegten Literaturrecherche wurden allen Chitinsynthasen individuelle Funktionen im Lebenszyklus von A. niger zugeschrieben. Außerdem wurden signifikant erhöhte Proteinkonzentrationen im Kulturüberstand mehrerer Knock-out Stämme nachgewiesen. Hierbei fiel besonders der Stamm A. niger LB9.1 (ΔchsF) auf, in dessen Kultur eine bis zu 300% erhöhte Proteinkonzentration festgestellt wurde. Die Analyse der differenziellen Genexpression sorgte für die Entdeckung zweier bisher unbekannter Transkriptionsfaktoren (ORF Codes: ATCC64974_43570 und ATCC64974_22400). Außerdem wurde die Expression eines potenziellen Sekundärmetabolitclusters um die Polyketid-Synthase codiert in dem ORF ATCC64974_109730 durch die Deletion des Genes csmA ca. 100-fach hochreguliert. Des Weiteren war die Expression verschiedener Gene, die eine Rolle in Glucansynthese und -modellierung sowie Chitinregulation spielen, durch die Deletion von Chitinsynthasegenen stark verändert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass beide Ziele dieser Arbeit erreicht wurden. Außerdem wurden zusätzliche Erkenntnisse, wie die Vorhersage zweiter Transkriptionsfaktoren und die Entdeckung der Hochregulation eines Sekundärmetabolitclusters, erlangt. Des Weiteren konnte das erste vergleichende hoch-durchsatz Synchrotron μCT Experiment die 3D Struktur hunderter Pilzpellets aufklären und damit einen prinzipiellen Beweis für die Anwendbarkeit dieser Methode liefern. Die in dieser Arbeit gewonnenen grundlegenden Erkenntnisse über das komplexe regulatorische Netzwerk der Chitinbiosynthese und damit des Wachstums und der Entwicklung von A. niger, haben das Potenzial zur Lösung aktueller und kommender globaler Herausforderungen wie der menschlichen Gesundheit, der Nahrungsmittelversorgung und einer insgesamt nachhaltigen und umweltfreundlichen Wirtschaft beizutragen.