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Probing anosteocytic fish bone structures using X-Ray interactions: from the effects of radiation damage to micro and nano analysis

Sauer, Katrein

Bones are frequently investigated using a variety of X-ray methodologies. These employ different contrasts such as absorption and phase contrast-enhanced micro-computed tomography (µCT), X-ray diffraction (XRD), and X-ray fluorescence (XRF). Approaches based on X-rays, however, lead to artefacts and may even cause structural damage due to the ionizing radiation. Bones are intricate nanocomposites consisting of protein, mineral, and water, densely packed into mineralized collagen fibrils and arranged into multilayered lamellae. In contrast to mammalian bones, which contain osteocyte cells that play a crucial role in adaptation and biochemical signaling, the bones of advanced teleosts, such as pike fish (Esox Lucius), have evolved to eliminate osteocytes from the bone microstructure. This observation suggests that these bones have a greater ability to resist mechanically induced damage than mammalian bones. The cleithrum is a bone, which plays a crucial role in the swift mouth-opening actions of the pike predator during the ’gape-and-suck’ feeding method, which places significant decades-long cyclic loading demands on it. This bone is highly resilient, yet not fully comprehended. In this project I make use of 2D and 3D imaging methods based on different contrasts and X-rays and add to that backscatter scanning electron microscopy (SEM-BEI), polarized light microscopy, and second harmonic generation (SHG) laser scanning microscopy, providing advantages for analyzing bony bio-composites. However, ionization radiation induces measurable damage effects. Excited by the incident X-ray beam, photon-electron cascades develop during measurements and ultimately lead to the breakdown of the composition and 3D arrangement of bones by the presence of mineral particles. Although needed for presenting highly resolved structural details of bone, high energy photons unleash major agents of damage, i.e., electrons, to bone collagen so that damage spreads beyond directly illuminated regions. In order to understand how the cleithrum structure contributes to the function, I combined mechanical loading by micro-indentation, three-point bending, and compression tests with high-resolution 2D and 3D imaging methodologies. Crystal lattice deformation down to the Angström level has shown residual strains seemingly placed exclusively near the surfaces of the cleithra. Thus, the fully functional, cyclically-loaded bone structure in fish benefits from a light-weight graded nanocomposite that is resistant to catastrophic damage propagation that endangers the survival of the fish. This thesis makes important contributions to future studies probing bone nanomechanical properties, while revealing critically important photon-electron-structure interactions. Future work should probably re-evaluate previous studies to better understand the role of these fundamental physics interactions on the current understanding of bone research and preservation. To that end, this thesis has implications spanning the fields of orthopaedics, biomedical scaffold research, and even bone archaeology.
Knochen relgelmäßig mit unterschiedlichen Kontrast-Verfahren zu untersuchen, ist heutzutage gängige Praxis. Zu den angewandten Verfahren gehören die Absorptions- und Phasenkontrast verstärkte Mikro-Computertomographie (µCT), die Röntgenbeugung (XRD) und Röntgenfluo reszenz (XRF). Allerdings können Anwendungen, die auf Röntgenstrahlen basieren, Artefakte und sogar strukturelle Schäden aufgrund der ionisierenden Strahlung verursachen. Knochen sind komplexe Nano-Verbundstoffe, die aus Proteinen, Mineralkristallen und Wasser bestehen und in dicht gepackten mineralisierten Kollagenfibrillen zu mehrschichtigen Lammellen angeordnet sind. Im Gegensatz zu Säugetierknochen, die Osteozytenzellen enthalten, haben sich die Knochen fortschrittlicher Knochenfische, wie die des Hechtes (Esox Lucius), so entwickelt, dass sie Osteozyten aus ihrer Knochenmikrostruktur eliminiert haben. Osteozyten spielen normalerweise eine entscheidende Rolle bei der Anpassung und der bio chemischen Signalgebung. Diese Beobachtung legt nahe, dass diese Fisch-Knochen ohne Osteozyten eine größere Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanisch induzierten Schäden besitzen, als Säugetierknochen. Das Cleithrum ist ein Hecht-Knochen, der eine entscheidende Rolle beim schnellen Aufreißen des Maules während der Fütterung spielt. Dadurch werden an ihn erhebliche zyklische Belastungsanforderungen über mehrere Jahrzehnte hinweg gestellt. Das Cleithrum ist äußerst widerstandsfähig, jedoch noch nicht vollständig verstanden. In dieser Arbeit verwende ich 2D- und 3D- Bildgebungsverfahren, die auf verschiedenen Kontrasten und Röntgenstrahlen basieren. Ich nutze Methoden wie die Rasterelektronenmikro skopie (REM), die Polarisationsmikroskopie sowie die Frequenzverdopplung (second harmonic generation (SHG)), die vorteilhaft bei der Analyse von knöchernen Biokompositmaterialien sind. Obwohl diese Methoden äußerst nützlich sind, birgt ihre Anwendung ein erhebliches Risiko an Strahlenschäden am Knochen, wenn diese auf ionisierenden Röntgenstrahlen basieren. Angeregt durch den einfallenden Röntgenstrahl entwickeln sich bei den Messungen, unter Anwesenheit von Mineralkristallen, Photon-Elektron-Kaskaden. Diese führen letztendlich zur Zersetzung der dreidimensionalen Knochenstruktur. Obwohl Röntgenstrahlen für die Darstellung hoch aufgelöster Strukturdetails von Knochen erforderlich sind, stellt die Hauptursache für die Schädigung am Knochen-Kollagen, die durch Röntgenphotonen angeregten hochenergetischen Elektronen dar. Diese Elektronen führen zu Schäden, die sich über die direkt bestrahlten Regionen hinaus ausbreiten. Um zu verstehen, wie die Struktur des Cleithrum-Knochens zur Funktion beiträgt, habe ich mechanische Belastungsuntersuchungen durch Mikroindentation, Dreipunkt-Biege- und Drucktests mit hochauflösenden 2D- und 3D-Bildgebungsverfahren kombiniert. Zusätzliche Beugungs-Experimente ergeben Deformationen des Kristallgitters auf der Angström-Ebene, die Dehnungsrückstände zeigen, die nur in der Nähe der Knochen-Oberflächen zu finden sind. Somit profitiert die voll funktionsfähige, zyklisch belastete Knochenstruktur des Fisches von einem leichtgewichtigen, graduell aufgebauten Nanokomposit, das widerstandsfähig ist gegenüber katastrophaler Schadensausbreitung, dass das Überleben des Fisches gefährdet. Diese Dissertation leistet wichtige Beiträge für zukünftige Studien um nanomechanische Eigenschaften von Knochen zu untersuchen und stellt dabei kritisch wichtige Wechselwir kungen zwischen Photonen, Elektronen und Strukturen dar. Zukünftige Arbeiten sollten wahrscheinlich frühere Studien neu bewerten, um die Rolle dieser grundlegenden physikalischen Wechselwirkungen für das derzeitige Verständnis von Knochenforschung und -erhaltung besser zu verstehen. In diesem Zusammenhang hat diese Dissertation Auswirkungen auf die Bereiche der Orthopädie, der biomedizinischen Scaffold-Forschung und der Knochenarchäologie.