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Incorporation of novel noncanonical amino acids in model proteins using rational and evolved variants of Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase

Exner, Matthias P.

Inst. Chemie

Der Einsatz von nichtkanonischen Aminosäuren zur Erforschung und Modifikation von Proteinfunktionen basiert auf etablierten Methoden. Dennoch gibt es einen Bedarf zur Verbesserung und Diversifizierung des "nichtkanonischen Werkzeugkastens". Diese Arbeit trägt zu diesem nichtkanonischen Werkzeugkasten in mehrfacher Hinsicht bei: Ein Suppressionssystem basierend auf Methanosarcina mazei Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase und der zugehörigen tRNAPyl wurde adaptiert, optimiert und verwendet, um bekannte Substrate in Proteine und Peptide zu einzubauen. Zusätzlich wurden die Möglichkeiten der Suppression in einem zellfreien Expressionssystem untersucht, wobei allerdings nur Vorarbeiten durchgeführt werden konnten. Die nichtkanonische Aminosäure S-Allylcystein (Sac) wurde erstmalig in Proteine eingebaut mittels Stoppcodonsuppression. Dazu wurde eine Aminosäurebindetaschenbibliothek von Methanosarcina mazei Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (MmPylRS) erzeugt und durch iterative Positiv-Negativ-Selektion eine neuartige MmPylRS Variante mit völlig veränderter Spezifität selektiert, die tRNAPyl mit S-Allylcystein belädt. Die neue Variante MmPylRS(C348W/W417S), als SacRS bezeichnet, wurde auf Substratspezifität und Effizienz untersucht und scheint hochspezifisch für Sac zu sein. S-Allylcystein kann posttranslational durch diverse bioorthogonale chemische Reaktionen modifiziert werden aufgrund der aktivierten Doppelbindung, einer funktionellen Gruppe, die im natürlichen Proteom nicht vorhanden und im Cytosol der meisten Organismen sehr selten ist, und hat somit potentielle Anwendungen als vielseitiger und spezifischer chemischer Angelpunkt. Die Möglichkeit der biosynthetischen Herstellung von Sac in situ, durch Fermentation oder Extraktion aus Pflanzen erhöht die Anwendbarkeit im industriellen Maßstab. Eine weitere MmPylRS-Bibliothek wurde nach einer Variante für die Aktivierung von Biocytin durchsucht, hat aber noch keinen Treffer erbracht. Zusätzlich wurden durch rationales Engineering der MmPylRS Varianten gesucht für den Einbau von langkettigen olefinischen Aminosäuren für posttranslationale Proteinmarkierung. Nε-Heptenoyllysine (Hnk) wurde zum ersten Mal in Proteine inkorporiert unter Verwendung der bereits beschriebenen polyspezifischen Variante MmPylRS(Y306A/Y384F), und der Einbau von Nε-Pentenoyllysine (Pnk) wurde zum ersten Mal mit einer signifikanten Effizienz durch Verwendung der Variante MmPylRS(C348A/Y384F) erreicht. Dabei wurde die Position C348 erstmalig rational modifiziert und die Polyspezifität der Variante MmPylRS(C348A/Y384F) ist zu vermuten. Darüber hinaus wurden durch die seitenkettenspezifische SPI-Methode die Aminosäuresurrogate Azidohomoalanin und Canavanin in Modellproteine eingebaut zur posttranslationalen chemischen Modifikation bzw. als Methode zur Untersuchung des Einflusses auf Proteinstrukturen. Eine grafische Zusammenfassung aller Einbauversuche ist Figure 1 auf Seite 3 zu entnehmen.
While the use of noncanonical amino acids to probe, modify or expand protein function comprises well established methodologies, there is still a demand for improvement and diversification of the "noncanonical toolkit". This work contributes to this noncanonical toolkit in several ways: A suppression system based on Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase and its cognate tRNAPyl was established, optimized and used to incorporate known substrates into proteins and peptides. Additionally, the possibilities of suppression in a cell-free expression system were explored, but no efficient system could be derived yet. The noncanonical amino acid S-allylcysteine (Sac) was incorporated into proteins for the first time via stop codon suppression. For this, an active-site library of Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS) was generated and an iterative positive-negative selection was set up to select a novel MmPylRS variant that charges tRNAPyl with S-allylcysteine, exerting an entirely altered reactivity compared to the natural enzyme. The novel variant MmPylRS(C348W/W417S), dubbed SacRS, was screened for substrate specificity and incorporation rate and was found to be highly specific for Sac. S-allylcysteine can be modified posttranslationally by diverse bioorthogonal chemical reactions due to the activated carbon double bond, a group absent from the natural proteome and with very low abundancy in the cytosol of most organisms, and thus has potential applications as a versatile chemical handle. The possibility of biosynthetically producing Sac in situ, by fermentation or extracting it from plants can facilitate applications on an industrial scale. Another MmPylRS library was screened for a variant that activates biocytin, but has yet to yield a hit. Additional rational engineering of MmPylRS enabled the incorporation of long-chain olefinic amino acids for protein posttranslational decoration. Nε-heptenoyllysine was incorporated for the first time using the known polyspecific variant MmPylRS(Y306A/Y384F), and incorporation of Nε-pentenoyllysine was achieved for the first time with significant efficiency using the variant MmPylRS(C348A/Y384F). This is the first instance of rationally engineering MmPylRS position C348, which may also prove useful for incorporation of other novel noncanonical amino acids. Furthermore, the residue-specific SPI method was employed to incorporate the known surrogates azidohomoalanine or canavanine into models proteins, for chemical modification or as a method to study the impact on protein structures, respectively. A graphical summary of all attempted incorporations is shown in Figure 1 on page 3.