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Quantitative approach for detection of RNA and proteins by sandwich hybridization technology

Osmekhina, Ekaterina

Inst. Biotechnologie

The detection and quantification of proteins and nucleic acids is an important procedure across a wide variety of biological disciplines and has forever changed and improved our ability to accurately determine unique traits in sample consistency. In this thesis, we show the applicability of a sandwich hybridization technology for the detection and quantification of (i) collagen prolyl-4-hydroxylase expression, (ii) Bacillus subtilis airborne spores and (ii) Salmonella in food samples. For collagen prolyl-4-hydroxylase detection, we developed a sandwich ELISA utilizing antibodies for two different subunits of the protein, optimized the procedure and the antibody concentrations using experimental design approach, and applied the method to monitor the recombinant protein concentration in crude cell extracts during its production in E. coli. To detect Bacillus subtilis spores from the air, we established a procedure that includes spore activation, germination, and enrichment cultivation, cell disruption, and RNA analysis using a sandwich hybridization assay (SHA). Using this process we were able to detect less than 10 spores in a single sample after 5 hours of enrichment cultivation. To analyze food samples for Salmonella contamination, we developed an improved enrichment cultivation procedure together with a SHA detection method. Salmonella 23S rRNA was selected as a target for the SHA. The SHA showed high selectivity toward S. Typhimurium, even in the presence of high concentration of background flora. Moreover, using the modified media, we achieved a significant improvement in the recovery of heat injured Salmonella cells. In this thesis we show that sandwich hybridization technology is a fast and convenient tool for the detection of a wide range of biomolecules in a variety of samples, demonstrating its potential and illustrating the possibilities for further development.
Der Nachweis und die Quantifizierung von Proteinen und Nukleinsäuren ist ein wichtiges Verfahren in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen und hat unsere Fähigkeit, einzigartige Merkmale in der Probenkonsistenz genau zu bestimmen, für immer verändert und verbessert. In dieser Arbeit wird das Potential der Sandwich-Hybridisierungstechnologie für die Quantifizierung von Zielmolekülen in verschiedenen Anwendungen aufgezeigt: (1) die funktionelle Expression von Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase, (2) für den quantitativen Nachweis von Bacillus-Sporen und (3) für die Detektion von Salmonellen in Lebensmittelproben. Für den Nachweis von Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase wurde ein Sandwich-ELISA unter Verwendung von Antikörpern für zwei verschiedenen Untereinheiten des Enzyms entwickelt und mit Hilfe des statistisch basierten Experimentellen Designs (DoE) optimiert. Dieser Assay wurde dann zur Bestimmung der heterologen Expression der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase in einem Escherichia coli Fed-batch Prozess angewandt. Zur Detektion von Bacillus-Sporen in der Luft, wurde am Beispiel von Bacillus subtilis ein Verfahren etabliert, das Sporenaktivierung, Keimung und Anreicherungskultivierung, Zellaufschluss und RNA-Analyse unter Verwendung eines Sandwich-Hybridisierungs-Assays (SHA) umfasst. Mit diesem Verfahren konnten nach fünf Stunden Anreicherungskultivierung in einer Probe weniger als 10 Sporen nachgewiesen werden. Schließlich wurde zur Detektion von Salmonellenkontaminationen in Nahrungsmittelproben ein verbessertes Anreicherungsanbauverfahren zusammen mit einer Sandwich-Hybridisierung als Nachweismethode entwickelt. Der auf der quantitativen Detektion von 23S rRNA basierende Assay zeigte eine hohe Selektivität gegenüber S. Typhimurium, sogar in Gegenwart einer hohen Konzentration der Hintergrundflora. Darüber hinaus wurde bei der Anreicherung durch die Verwendung modifizierter Medien eine signifikante Erhöhung der Ausbeute an Salmonella-RNA aus vorher hitzegeschädigten Proben erhalten und damit eine wesentliche Erhöhung der Sensitivität. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit das Potential der Sandwich-Hybridisierungstechnologie als eine einfach zu etablierende und sehr sensitive Methode zum quantitativen Nachweis von Biomolekülen für unterschiedliche Anwendungsbereiche in der mikrobiellen Diagnostik aufgezeigt werden, was trotz neuer alternativer Entwicklungen auf dem Gebiet, das Potential der Methode dokumentiert.