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Nachweis und Charakterisierung von Hepatitis-E-Viren und Cosaviren in Umweltproben

Beyer, Sophia

FG Umweltmikrobiologie

Durch die Überwachung von humanpathogenen Viren in der Umwelt können Infektionsgeschehen in der Bevölkerung kontrolliert sowie mögliche Übertragungen über die Umwelt abgeschätzt werden. In der vorliegenden Arbeit war das Vorkommen von Hepatitis-E-Viren (HEV) und Cosaviren (CoSV) in Umweltproben in Deutschland von hauptsächlichem Interesse. Das Vorhandensein der beiden zoonotischen RNA-Viren wurde vor allem im Berliner Raum untersucht. Für den Nachweis von HEV in Abwasser- und Oberflächengewässerproben eigneten sich Proben ohne Aufkonzentrierung (Direktproben) sowie via Ultrazentrifugation (UZ) aufkonzentrierte Proben am besten. Cosaviren hingegen ließen sich am besten in Proben, die mittels UZ oder Polyethylenglykol (PEG)-Fällung aufkonzentriert wurden, detektieren. Die ermittelten Viruskonzentrationen werden von der verwendeten Aufkonzentrierungsmethode beeinflusst. Beim Vergleich verschiedener Studien sollten die Ergebnisse daher immer im Zusammenhang mit dem Verfahren der Aufkonzentrierung bewertet werden. Während der einjährigen Abwasserüberwachung einer Berliner Kläranlage wurden durchschnittliche HEV-Konzentrationen von 2x10^4 Kopien/100 ml (Direktproben) beziehungsweise 4x10^3 Kopien/100 ml (UZ-Proben) in den Zulaufproben mittels RT-qPCR quantifiziert. In den korrespondierenden Ablaufproben war die Konzentration an HEV mindestens um 1 Log10-Stufe reduziert. In den Sommermonaten wird der Ablauf der Kläranlage zusätzlich mit UV-Licht desinfiziert, wodurch die Viruseliminierung noch gesteigert wird. Besonders deutlich zeigte sich der Desinfektionseffekt im Lebendnachweisverfahren von Phagen. In mit UV-Licht bestrahlten Kläranlagenablaufproben waren alle somatischen Coliphagen und F+-spezifischen RNA-Phagen inaktiviert. Die quantitative PCR hingegen stellt kein geeignetes Verfahren dar, um das Vorhandensein von aktiven Viren in Wasserproben nach einer UV-Desinfektion zu bewerten, da die Nukleinsäuren weitgehend erhalten bleiben. Cosaviren wurden in den monatlichen Kläranlagenzulaufproben insgesamt in geringeren Konzentrationen als HEV detektiert. Durchschnittlich wurden 7x10^2 CoSV-Kopien/100 ml (PEG-Proben) beziehungsweise 9x10^2 CoSV-Kopien/100 ml (UZ-Proben) nachgewiesen. Insgesamt konnte die Häufigkeit der humanpathogenen Viren im Abwasser, die in dieser Arbeit untersucht wurden, in folgende Reihenfolge gebracht werden: Humane Adenoviren (HAdV) > Humane Noroviren (HNV) > Hepatitis-E-Viren > Cosaviren. HEV und CoSV kommen ganzjährig in ähnlichen Konzentrationen im Abwasser vor und zeigen daher keine saisonalen Unterschiede im Vorkommen. Alle Kläranlagenablaufproben und Berliner Oberflächengewässerproben waren CoSV RNA negativ. Somit besteht keine Gefahr einer CoSV-Infektion durch Freizeitaktivitäten in den untersuchten Berliner Gewässern. Falls CoSV jedoch in hohen Konzentrationen in Oberflächengewässern vorkommen, wie in einer untersuchten fäkal belasteten indischen Flussprobe, können sie dort ebenfalls quantifiziert werden (6x10^2 Kopien/100 ml). HEV konnten hingegen in Berliner Oberflächengewässerproben nachgewiesen werden. In 30 % der Havel-Flussproben konnte HEV RNA detektiert werden, wobei die positiven Proben einen Median von 9x10^2 HEV-Kopien/100 ml besaßen. Ebenfalls wurden zum Teil hohe Konzentrationen an HAdV ermittelt. In Flussproben der Spree wurden im Gegensatz zur Havel geringere HEV-Detektionsraten (19 %) und Konzentrationen (6x10^2 HEV-Kopien/100 ml) identifiziert. Humane Adenoviren und Noroviren wurden ebenfalls nur vereinzelt nachgewiesen. Die Spree ist ein sauberer Fluss, von dem bei normalen Wetterbedingungen eine sehr geringe Gefahr einer HEV-Infektion durch Freizeitaktivitäten im Wasser ausgeht. Nach Starkregenereignissen kann es jedoch zu einem starken Konzentrationsanstieg von humanpathogenen Viren in der Spree kommen. Durch Mischwasserüberläufe gelangt dann ungeklärtes Abwasser zusammen mit Regenwasser in den Fluss. Dies äußert sich in der auf 75 % gestiegenen HEV-Detektionsrate mit durchschnittlich 3x10^3 HEV-Kopien/100 ml in Spreeproben nach starken Regenfällen. Auf Freizeitaktivitäten in der Spree sollte direkt nach extremen Niederschlägen verzichtet werden, da das Risiko einer Infektion mit HEV und anderen humanpathogenen Erregern erhöht sein könnte. An der Badestelle „Kleine Badewiese“, die stromabwärts des Flusses Havel gelegen ist, wurden während der Badesaison nur in vereinzelten Proben (15 %) geringe HEV-Konzentrationen nachgewiesen. Es konnten auch keine anderen Indikatorviren für fäkale Verunreinigungen detektiert werden. In den Sommermonaten besteht somit für die Badegäste an der Badestelle in der Havel kein erhöhtes Risiko für Virusinfektionen. Um den tierischen Eintrag von HEV in die Umwelt zu untersuchen, wurden Oberflächengewässerproben aus Forstrevieren in Brandenburg parallel zu Wildschweinleberproben (untersucht am BfR) aus demselben Gebiet auf HEV getestet. Die geringe HEV-Detektionsrate in den Umweltproben und die durchweg HEV RNA negativen Wildschweinleberproben deuteten darauf hin, dass zum Zeitpunkt der Untersuchungen kein akutes HEV-Infektionsgeschehen in den Wildschweinpopulationen vorherrschte. Die nachgewiesenen HEV-Fragmente wurden via nested-RT-PCR weiter charakterisiert. Für die Genotypisierung eigneten sich vor allem mittels UZ oder PEG-Fällung aufkonzentrierte Proben. Alle in den Umweltproben identifizierten HEV gehörten dem Genotypen HEV-3 an. Zehn der isolierten HEV-Sequenzen konnten dem Subgenotyp HEV-3c zugeordnet werden, welcher somit in den Berliner Abwasserproben vorherrschend war. Zwei Isolate wurden als HEV-3f identifiziert. Drei Sequenzen konnten nicht eindeutig zugeordnet werden, waren aber zweimal wahrscheinlich dem Subtyp HEV-3a und einmal HEV-3c oder HEV-3i zugehörig. Die in den Umweltproben charakterisierten HEV-Isolate wurden außerdem mit publizierten Sequenzen von HEV-infizierten Patienten aus Berlin auf Homologien verglichen. In den Patientenproben spiegelten sich die Subgenotypen der Umweltproben wider, HEV-3c wurde am häufigsten identifiziert und HEV-3f konnte ebenfalls detektiert werden. Da die HEV-Sequenzen aus Umwelt- und Patientenproben innerhalb des phylogenetischen Stammbaums clusterten, kann eine geringe genetische Distanz der Isolate vermutet werden. Die übereinstimmenden HEV-Subgenotypen, die in der Umwelt und der Bevölkerung zirkulieren, deuten auf eine Korrelation hin und bestätigen die Annahme, dass sich das Infektionsgeschehen der Bevölkerung im Abwasser widerspiegelt und dadurch wertvolle Informationen über das aktuelle Infektionsgeschehen liefern kann.  
Environmental surveillance of human pathogenic viruses is a tool for assessing emerging infections in the human population and possible environmental transmission pathways. In the present study, emphasis is given to the prevalence of hepatitis E viruses (HEV) and cosaviruses (CoSV) in environmental samples from Germany. The occurrence of both zoonotic RNA viruses was primarily investigated in the Berlin area. For detection of HEV in wastewaters and surface waters, samples without virus concentration steps (direct samples) and via ultracentrifugation (UC) concentrated samples were most suited. Cosaviruses were detected in ultracentrifugated and polyethylene glycol (PEG) precipitated samples the best. Determined virus concentrations depend on the used virus concentration methods. When comparing different studies results should always be evaluated considering the virus concentration techniques. During the one-year HEV surveillance of a Berlin wastewater treatment plant (WWTP) samples were quantified by RT-qPCR. HEV concentrations of influent samples were 2x10^4 copies/100 ml (direct samples) and 4x10^3 copies/100 ml (UC samples), respectively. In the corresponding effluent samples HEV concentrations were reduced at least by 1 Log10 unit. During summer season WWTP effluents were additionally disinfected with UV light whereby virus elimination was even increased. This disinfection effect was particularly noticeable when bacteriophage concentrations were measured by infection-based detection methods. In WWTP effluent samples treated with UV light all somatic coliphages and F+-specific RNA-phages were inactivated. However, quantitative PCR is not an appropriate method to assess the presence of active viruses in water samples after disinfection with UV light since nucleic acids remain largely intact. Cosaviruses were detected in lower concentrations than HEV in the monthly WWTP samples. Average concentrations of influent samples were 7x10^2 CoSV-copies/100 ml (PEG samples) and 9x10^2 CoSV-copies/100 ml (UC samples), respectively. Overall frequency of human pathogenic viruses tested in wastewater samples was in the order of: human adenoviruses (HAdV) > human noroviruses (HNV) > hepatitis E viruses > cosaviruses. HEV and CoSV occur in similar concentrations in wastewater samples during the surveilled year, therefore no obvious seasonal pattern was observed. All WWTP effluent samples and Berlin surface water samples were CoSV RNA negative. Thus, there is no risk of CoSV infection during recreational activities in the investigated Berlin waters. If CoSV occur in high concentrations, they can be quantified as well in surface waters, as shown by testing a fecal contaminated Indian river sample (6x10^2 CoSV-copies/100 ml). In contrast, HEV were detected in Berlin surface water samples. In 30 % of Havel river samples HEV RNA were identified with a median concentration of 9x10^2 HEV-copies/100 ml of positive samples. Some high concentrations of HAdV were also detected in the Havel samples. In water samples of the river Spree lower HEV detection rates (19 %) and concentrations (6x10^2 HEV-copies/100 ml) in comparison to the river Havel were identified. HAdV and HNV were detected only sporadic. Therefore, the Spree is an unpolluted river that poses only a very low risk of HEV infection during water based recreational activities under normal weather conditions. But after heavy rainfall events sharp increases of human pathogenic virus concentrations in the river Spree could occur. In this case untreated wastewater together with rainwater enters the river by combined sewer overflows. This is reflected in the increased HEV detection rate of 75 % with mean concentrations of 3x10^3 HEV-copies/100 ml in Spree water samples after extraordinary rainfalls. Recreational activities in the river Spree directly after heavy rainfall events should be avoided since the infection risk of HEV and other human pathogenic viruses may be increased. At the bathing area “Kleine Badewiese” located downstream the river Havel only few water samples were HEV RNA positive (15 %) with low HEV concentrations during the bathing season. Besides that, no other viral indicators of fecal contaminations were detected. Therefore, no increased risk of virus infections for the bathers was found at this bathing area during the summer months. To assess HEV of animal origin in the environment, surface water samples of forest districts in Brandenburg parallel to wild boar liver samples (investigated at the BfR) from the same territory were tested for HEV RNA. The low HEV detection rate in environmental samples and consistently HEV RNA negative liver samples indicate that there were no active HEV infections in the wild boar populations at the time of investigation. To further characterize detected HEV fragments nested-RT-PCR and subsequent genotyping was carried out. By UC or PEG precipitation concentrated samples were most suited for this characterization. All HEV originating from environmental samples belonged to genotype HEV 3. Ten HEV sequences were classified as subgenotype HEV-3c, which is the most prevalent HEV subtype in Berlin wastewater samples. Two isolates contained HEV genotype 3f. Of three samples which could not be subtyped exactly, two were most likely of subtype 3a and one of subtype 3c or 3i. HEV strains obtained from Berlin environmental samples were compared to sequences of HEV infected patients from the same area. HEV isolates from patient samples correlate with subtypes identified in wastewater samples: HEV-3c was the most common type und HEV-3f was also identified. As HEV sequences from environment and patients clustered within a phylogenetic tree, a low level of genetic distance can be assumed. Corresponding HEV subgenotypes circulating in the environment and humans suggest an existing correlation and confirm that infections from the population are reflected in wastewater samples and could provide precious information of current infections.