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Intracellular transport and protein processing in a non-viral transfection model
Riechers, Sean-Patrick
Saccharomyces cerevisiae wird allgemein als Modellsystem zur Untersuchung der Endocytose genutzt. Ergebnisse, die in Hefe gewonnen wurden, können in Bezug auf fast alle Aspekte auf das Säugersystem übertragen werden. Hier wurden definierte Deletionsstämme genutzt, um Schritte im endocytotischen Transport, in der endosomal/lysosomalen Ansäuerung und in dem intrazellulären Transport von Hydrolasen sowie Hydrolasen selbst zu identifizieren und zu lokalisieren, die die DNS Aufnahme und Freisetzung in der nicht-viralen Transfektion beeinflussen. Des Weiteren wurden in entsprechenden Deletionsmutanten Golgi-Proteine, Zellwandbestandteile und deren Transport zu ihren Wildtyp-Lokalisationen und teilweise auch der Einfluss von Aktin und seinen korrespondierenden Proteinen untersucht auf Effekte bezüglich der Transfektionseffizienz. Transportinhibierung in späteren endocytotischen Schritten, wie in der vps21 Mutante, erhöht die Transfektionseffizienz. Durch Quinacrine-Färbung-Untersuchungen unter Transfektionsbedingungen wurde gezeigt, dass eine Modifizierung des pH-Wertes im endosomal/vakuolären System, wie zum Beispiel in den Mutanten vph1 und stv1, zu einer erhöhten Transfektionseffizienz führt. Die Effizienz ist ebenfalls in spezifischen Fällen erhöht, wenn die Ionenzusammensetzung des endosomalen Systems beeinflusst wird (nhx1). Eine erhöhte Transfektionseffizienz wurde außerdem in Mutanten beobachtet, welche in dem CVT/Autophagie Prozess oder dem Transport von Hydrolasen zur Vakuole mutiert sind, wie in der Mutante vac8. Die Transfektionseffizienz kann des Weiteren erhöht werden durch Defekte an prozessierenden Proteinen des Golgi, wie in der kex2 Mutante, die defekt ist für eine wichtige prozessierende Golgi Protease, in der och1 Mutante, die defekt ist für ein Protein, dass in der frühen N-Glykosylierung des Golgi wichtig ist oder durch Beeinflussung der Wildtyp-Funktion dieser Proteine durch Deletion von PMR1, welches für den Golgi Mn2+/Ca2+-Import Transporter kodiert. Die Funktion von Kex2p ist abhängig von Ca2+-Ionen und die Funktion von Och1p von Mn2+-Ionen. Die natürliche Funktion von Kex2p könnte auch beeinflusst werden durch Disfunktionen in seinem Transport zwischen dem trans-Golgi-Netzwerk und den Endosomen. In dieser Promotionsarbeit wird ein Interaktionsnetzwerk der transfektions-beeinflussenden Faktoren präsentiert, welches Kex2p, Och1p, Pmr1p, Stv1p, Vph1p und Nhx1p beinhaltet. Zum Schluss kann noch gesagt werden, dass Einzeldefekte von Zellwandproteinen oder Proteinen, die involviert sind in den Aktin-Metabolismus, scheinbar nicht geeignet sind um die Transfektionseffizienz zu erhöhen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die nicht-virale Transfektionseffizienz erhöht werden kann durch (i) die Inhibierung des Transportes endocytierten Materials, bevor es vakuoläre Bedingungen erreicht, (ii) die Erzeugung eines nicht natürlichen pH-Wertes in dem endosomal/vakuolären System, (iii) die Verlangsamung degradativer Prozesse durch Inhibierung vakuolärer Hydrolasen oder des Transports zwischen Golgi und dem späten Endosom/der Vakuole oder (iv) die Inhibierung/Unterbrechung der Prozessierung im Golgi.
Saccharomyces cerevisiae is commonly used as a model system to study endocytosis. Results obtained with yeast can be transferred to the mammalian system in almost all aspects. Here, defined deletion mutants were utilized to identify and locate steps in endocytic transport, endosomal/lysosomal acidification and in intracellular transport of hydrolases, and hydrolases itself which influence DNA delivery in non-viral transfection. Furthermore, Golgi proteins, cell wall constituents and their transport to wild-type locations, and, partially, also the involvement of actin and its corresponding proteins were tested for effects on transfection efficiency in deletion mutants. Transport inhibition in later endocytic steps, such as in the vps21 mutant, enhances transfection efficiency. By applying transfection conditions in combination with quinacrine staining, it was demonstrated that modifying the pH-value of the endosomal/vacuolar system, for example in the vph1 and stv1 mutants, leads to enhanced transfection efficiency. Efficiency is also elevated in specific cases when the ion composition of the endosomal system is affected (nhx1). Enhanced transfection efficiency was further observed in mutants which are mutated in the CVT/autophagy pathway or hydrolase transport to the vacuole as in mutant vac8. Transfection efficiency can be further enhanced by deleting Golgi processing proteins as with the kex2 mutant deficient for an important Golgi processing protease, the och1 mutant deficient for an early Golgi participant in N-glycosylation, or by affecting these proteins' wild-type function by deleting PMR1 coding for the Golgi Mn2+/Ca2+-importing transporter. The function of Kex2p is dependent on Ca2+–ions and the function of Och1p on Mn2+–ions. Proper function of Kex2p might also be affected by malfunctions in the transport between the trans-Golgi network and endosomes. In this study, an interaction network affecting transfection is presented between Kex2p, Och1p, Pmr1p, Stv1p, Vph1p and Nhx1p. Finally, single defects affecting cell wall proteins or proteins involved in actin metabolism seem to be inappropriate to use to enhance transfection efficiency. In summary, non-viral transfection efficiency can be enhanced by (i) inhibiting the transport of endocytosed material before it meets vacuolar conditions, (ii) inducing a non-natural pH-value of the endosomal/vacuolar system, (iii) slowing down degradative processes by inhibiting vacuolar hydrolases or the transport between Golgi and late endosome/vacuole, or (iv) inhibiting/interrupting Golgi processing.
