Delayed local delivery of synthetic prostacyclin to modulate inflammatory processes in support of bone regeneration

dc.contributor.advisorLauster, Roland
dc.contributor.authorWendler, Sebastian
dc.contributor.grantorTechnische Universität Berlinen
dc.contributor.refereeLauster, Roland
dc.contributor.refereeDuda, Georg N.
dc.contributor.refereeKurreck, Jens
dc.date.accepted2019-10-18
dc.date.accessioned2019-11-18T14:47:33Z
dc.date.available2019-11-18T14:47:33Z
dc.date.issued2019
dc.description.abstractDelayed fracture healing or non-unions are relevant challenges in the clinical setting with a prevalence of more than 10 % of the regeneration outcomes. Autologous bone grafting or local application of growth factors such as bone morphogenic protein 2 (BMP-2) are considered to be current therapeutic gold standards. However, BMP-2 is expansive and over-dosage led to reports of negative side effects resulting in a more restricted application of such additive factors. In particular, for non-critical size defects, alternative methods might be to target those cells that block or alter healing cascades instead of focusing only onto boosting the positive elements of bone formation. A brief and highly regulated secretion of pro-inflammatory molecules is critical to initiate tissue regeneration, which is followed by an anti-inflammatory phase. Only afterwards, the tissue restoration can take place. Hence, elongation of inflammation can lead to delayed fracture healing or even non-unions, indicating immune cells as alternative therapeutic targets. The hypothesis of this doctoral thesis was that the delayed local application of an anti-inflammatory molecule, such as prostacyclin (PGI2), shortens the inflammatory phases of bone healing and therefore accelerates the regenerative process. Application of the synthetic PGI2 analog Iloprost on CD3/CD28-activated T cells revealed a reduction of pro-inflammatory cytokines such as interferon γ (INF-γ) or tumor necrosis factor α (TNF-α) in a dose dependent manner. In particular, the PGI2 analog suppressed isolated CD8+ proliferation and cytokine secretion. Furthermore, pro-inflammatory M1-type macrophages were reduced in their activity in response to synthetic PGI2, whereas anti-inflammatory M2-type macrophages could be further stimulated. Activated T regulatory cells (Treg) could not be stimulated significantly further with the drug. On the contrary, non-stimulated Treg showed higher anti-inflammatory interleukin 10 (IL-10) secretion as a pharmacologic response. Conditioned media were harvested from activated T cells within bone marrow cultures, and from isolated and activated CD8+ cells and Treg. Applied onto osteogenic differentiating mesenchymal stromal cells (MSCs), inhibitory effects of the cytokine-enriched media were detected on mineralization capacity and cell viability. Prior PGI2-treatment on the immune cell cultures could significantly reduce these inflammatory effects and in particular on cytokine-induced apoptosis. Furthermore, no negative effects of Iloprost were observed neither in osteogenic nor chondrogenic differentiation when directly applied on bone marrow derived MSCs (BM-MSCs). However, proliferative activity was reduced and sporadic adipogenic differentiation occurred with the highest applied dose. These in vitro data indicated that the pro-inflammatory phase at its peak constitutes the optimal pharmacologic target for time-dependent PGI2 application to accelerate the bone healing process. Since the initial inflammation is necessary to induce the regenerative process, a delayed drug application after fracture was considered crucial for modulating the inflammatory phases. Moreover, the anti-coagulative PGI2 could lead to an interference with the early endogenous hematoma formation. To achieve this, a local drug delivery approach was chosen and investigated with medical grade fibrin as a hydrogel-based carrier material. The fibrin matrix was loaded with PGI2 and a non-loaded shell of fibrin was modulated around it. In vitro drug release with in vivo-like conditions (37 °C and proteinase K in physiologic solution) was performed and liquid-liquid extracted samples were analyzed with reversed phase high performance liquid chromatography with ultra violet detector (RP-HPLC/UV). Obtained kinetics revealed a delayed drug release of 24 hours with the core-shell system compared to core alone. After complete release of Iloprost, the fibrin matrices collapsed due to degradation. A non-critical size defect mouse model was used for the proof of concept, which is characterized by a defined fracture gap into which the drug release system was placed. Indeed, significantly increased volumes of newly formed bone were detected in the mouse osteotomy model after 21 days post osteotomy (dpo). Histology revealed more advanced endochondral phases in the PGI2 treatment group compared to the control. At an earlier time point of 3 dpo fibrin material of the release system was not degraded yet in the fracture gap. In this osteotomy model, 3 dpo is considered subsequent of the peak pro-inflammatory phase, and after 3 days a major amount of PGI2 was presumably released into the observed area – according to the in vitro release kinetics. In fact, at 3 dpo, significantly reduced numbers of CD8+ cells were detected with decelerated PGI2 release. Moreover, CD8+ cells were inhibited in activity, indicated by double staining for IFN-γ. CD4+ cells, which comprise the Treg fraction, were additionally decreased at 3 dpo after treatment. Analysis of the response of the innate immune cells was again carried out onto macrophage polarization. The impact onto polarization with delayed PGI2 release was suppression and increase in M1 and M2 macrophages, respectively. Additionally, delayed release of synthetic PGI2 diminished CD68+ cell fraction, which contains macrophages. Moreover, CD68+TNF-α+ cells were pharmacologically reduced as well. Taken together, delayed release of synthetic PGI2 can support fracture healing via immune modulation and constitutes a viable alternative to growth factor applications.en
dc.description.abstractVerzögerte Frakturheilung oder Pseudoarthrosen sind relevante klinische Herausforderungen mit einer Prävalenz von mehr als 10 % in den regenerativen Ergebnissen. Autologe Knochentransplantation oder lokale Applikation von Wachstumsfaktoren, wie bone morphogenic protein 2 (BMP-2) werden als aktuelle therapeutische Goldstandards angesehen. Jedoch führten die hohen Kosten und Berichte über negative Nebenwirkungen insbesondere bei Überdosierung von BMP-2 zu einer vorsichtigeren Anwendung solch additiver Faktoren. Insbesondere bei nicht-kritischen Defekten könnten alternative Methoden auf diejenigen Zellen abzielen, die die Heilungskaskaden blockieren oder verändern, anstatt lediglich auf die positiven Elemente zur Verstärkung der Knochenbildung zu fokussieren. Eine knappe und stark regulierte Sekretion von proinflammatorischen Molekülen ist kritisch für die Initiierung der Geweberegeneration, welche von einer antiinflammatorischen Phase gefolgt wird. Erst anschließend kann die Geweberestauration geschehen. Deshalb kann eine Verlängerung der Entzündung zu verzögerter Frakturheilung oder gar Nichtvereinigung führen, was Immunzellen als therapeutische Alternative indiziert. Die Hypothese dieser Doktorarbeit war, dass die verzögerte lokale Freisetzung eines anti-inflammatorischen Moleküls, wie Prostacyclin (PGI2), die inflammatorische Phasen der Knochenheilung verkürzt und deshalb den regenerativen Prozess beschleunigt. Anwendung des synthetischen PGI2-Analogs Iloprost auf CD3/CD28-aktivierte T-Zellen offenbarte eine dosisabhängige Reduktion proinflammatorischer Moleküle, wie Interferon-γ (INF-γ) oder Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). Insbesondere unterdrückte das PGI2-Analog die Proliferation und die Zytokinsekretion isolierter CD8+ Zellen. Darüber hinaus waren proinflammatorische Makrophagen vom M1-Typ in Reaktion auf synthetisches PGI2 in ihrer Aktivität reduziert, während antiinflammatorische Makrophagen vom M2-Typ zusätzlich stimuliert werden konnten. Aktivierte T-regulatorische Zellen (Treg) konnten mit dem Wirkstoff nicht weiter signifikant stimuliert werden. Im Gegensatz dazu zeigten nicht stimulierte Treg eine höhere entzündungshemmende Sekretion von Interleukin 10 (IL-10) als pharmakologische Reaktion. Konditionierte Medien wurden von aktivierten T-Zellen innerhalb von Knochenmarkskulturen gewonnen, sowie von isolierten CD8+ Zellen und Treg. Auf osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) angewendet, wurden inhibitorische Wirkungen der mit Zytokinen angereicherten Medien auf Mineralisierungskapazität und Zellvitalität nachgewiesen. PGI2-Vorbehandlung der Immunzellkulturen konnte diese entzündlichen Wirkungen und insbesondere die Zytokin-induzierte Apoptose signifikant reduzieren. Außerdem wurden keine negativen Wirkungen von Iloprost beobachtet, weder in osteogener noch in chondrogener Differenzierung, wenn direkt auf aus Knochenmark stammenden MSCs angewendet. Jedoch war die proliferative Aktivität verringert und sporadische adipogene Differenzierung trat auf mit der höchsten angewendeten Dosis. Diese in vitro Daten zeigten, dass im Knochenheilungsprozess die proinflammatorische Phase zu ihrem Höhepunkt das optimale pharmakologische Ziel für die zeitabhängige Anwendung von PGI2 darstellt. Da die initiale Entzündung nötig für die Induzierung des regenerativen Prozesses ist, wurde eine verzögerte Wirkstoffapplikation nach der Fraktur als entscheidend für die Modulation der Entzündungsphasen angesehen. Zudem könnte das anti-koagulative PGI2 zu einer Störung der frühen endogenen Hämatombildung führen. Um dies zu erreichen, wurde ein lokaler Ansatz zur Medikamentenabgabe gewählt und mit medizinischem Fibrin als Trägermaterial auf Hydrogelbasis untersucht. Die Fibrinmatrix wurde mit PGI2 beladen und um sie herum wurde eine nicht beladene Hülle aus Fibrin moduliert. Die Arzneimittelfreisetzung wurde in vitro durchgeführt mit in-vivo-ähnlichen Zuständen (37 ° C und Proteinase K in physiologischer Lösung), und flüssig-flüssig extrahierte Proben wurden mit Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit einem Ultraviolett-Detektor (RP-HPLC/UV) analysiert. Die erhaltene Kinetik ergab eine um 24 Sunden verzögerte Medikamentenfreisetzung des Kern-Hülle-Systems im Vergleich zum Kern allein. Nach vollständiger Freisetzung von Iloprost kollabierten die Fibrinmatrizen aufgrund von Auflösungsprozessen. Für den Proof-of-Concept wurde ein nicht kritisches Defektmausmodell verwendet, das durch eine definierte Bruchlücke gekennzeichnet ist, in die das Wirkstofffreisetzungssystem eingebracht wurde. Tatsächlich wurden im Mausosteotomiemodell 21 Tage nach Osteotomie (dpo) signifikant erhöhte Volumina neu gebildeten Knochens nachgewiesen. Die Histologie zeigte im Vergleich zur Kontrolle weiter fortgeschrittene endochondrale Phasen in der PGI2-Behandlungsgruppe. Zu einem früheren Zeitpunkt von 3 dpo war das Fibrinmaterial des Freisetzungssystems im Frakturspalt noch nicht abgebaut. In diesem Osteotomiemodell wird 3 dpo als Folge der maximalen proinflammatorischen Phase betrachtet, und nachdem vermutlich eine größere Menge an PGI2 in den beobachteten Bereich freigesetzt worden war – hinsichtlich der in vitro Freisetzungskinetik. In der Tat wurde nach 3 dpo eine signifikant verringerte Anzahl von CD8+ Zellen mit verlangsamter PGI2-Freisetzung nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Aktivität von CD8+ Zellen gehemmt, was durch Doppelfärbung mit IFN-γ angezeigt wird. CD4+ Zellen, die die Treg-Fraktion umfassen, wurden nach der Behandlung bei 3 dpo zusätzlich verringert. Die Analyse der Reaktion der angeborenen Immunzellen wurde erneut anhand von Makrophagenpolarisation durchgeführt. Der Einfluss auf die Polarisation mit verzögerter PGI2-Freisetzung war entweder Unterdrückung oder Zunahme der M1- oder M2-Makrophagen. Zusätzlich verringerte die verzögerte Freisetzung von synthetischem PGI2 die CD68+ Zellfraktion, welche Makrophagen beinhaltet. Darüber hinaus wurden CD68+TNF-α+ Zellen auch pharmakologisch reduziert. Zusammengenommen kann die verzögerte Freisetzung von synthetischem PGI2 die Frakturheilung durch Immunmodulation unterstützen und stellt eine praktikable Alternative zu Wachstumsfaktoranwendungen dar.de
dc.identifier.urihttps://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/10173
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.14279/depositonce-9162
dc.language.isoenen
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/en
dc.subject.ddc620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeitende
dc.subject.ddc610 Medizin und Gesundheitde
dc.subject.otherlocal drug releaseen
dc.subject.otherbone regenerationen
dc.subject.otherbiomaterialsen
dc.subject.otherlokale medikamentöse Freisetzungde
dc.subject.otherBiomaterialiende
dc.subject.otherOsteoimmunologiede
dc.titleDelayed local delivery of synthetic prostacyclin to modulate inflammatory processes in support of bone regenerationen
dc.title.translatedVerzögerte lokale Freisetzung von synthetischem Prostazyklin zur Modulation entzündlicher Prozesse zur Unterstützung der Knochenregenerationde
dc.typeDoctoral Thesisen
dc.type.versionacceptedVersionen
tub.accessrights.dnbfreeen
tub.affiliationFak. 3 Prozesswissenschaften>Inst. Biotechnologie>FG Medizinische Biotechnologiede
tub.affiliation.facultyFak. 3 Prozesswissenschaftende
tub.affiliation.groupFG Medizinische Biotechnologiede
tub.affiliation.instituteInst. Biotechnologiede
tub.publisher.universityorinstitutionTechnische Universität Berlinen
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