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Entwicklung und Charakterisierung von Tamoxifen-regulierbaren onkolytischen adenoviralen Vektoren zur Behandlung von Tumorerkrankungen

Sipo, Isaac

In der vorliegenden Dissertation wurden vier Fusionsproteine ME, MEM, EM und ENLSM durch Fusion des adenoviralen pRB-Bindungsdomäne-deletierten E1A-Mutanten (E1ApRB) mit der mutierten HBD des Maus-ER (Mer) konstruiert, mit dem Ziel, ihre Aktivität in Abhängigkeit von Tam- bzw. OHT zu kontrollieren. Die systematische Charakterisierung der Fusionsproteine ergab, dass alle Konstrukte in Abhängigkeit von Tam bzw. OHT die Funktionen des nativen adenoviralen E1A-Proteins beibehalten. Auf dieser Grundlage wurden vier lungenspezifische Tam-regulierbare oAdV (Tam-oAdV) entwickelt (Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM bzw. Ad.ENLSM), in denen die kodierenden cDNA für die Fusionsproteine ME, MEM, EM bzw. ENLSM unter Kontrolle des SP-B Promotors in die E1-Region eines E1/E3-deletierten AdV-Genoms inseriert wurden. Ad.MEM und Ad.ENLSM wiesen die bessere Regulationskapazität auf, während Ad.EM eine niedrigere Regulationskapazität im Vergleich zu Ad.MEM und Ad.ENLSM aber eine effizientere Replikation und Onkolyse zeigte. Das Konstrukt Ad.ME war hingegen durch eine ineffiziente Regulation und ein niedriges onkolytisches Potential gekennzeichnet. In Mäusen mit subkutanen humanen Lungen-Adenokarzinomxenograften zeigten Ad.EM und Ad.ENLSM, einen signifikanten Antitumoreffekt in Tam-behandelten Mäusen, aber eine ineffiziente Tam-abhängige Regulation. Eine Kombination der Tam-oAdV mit dem tTS ermöglichte eine Steigerung der Regulationskapazität der Replikation der Tam-oAdV. Des Weiteren wurde durch Trans-Komplementierung der Replikation eines FasL-exprimierenden Ad-Vektors (Ad5Tight1-FasL) durch Ad.MEM bzw. Ad.ENLSM in H441-Zellen einen OHT-abhängigen synergistischen Effekt auf der onkolytischen Effizienz der Tam-oAdV erzielt. In der Summe wurde in dieser Arbeit eine neue Generation von pharmakologisch regulierbaren oAdV entwickelt, deren Regulationsprinzip im Gegensatz zu den bisherigen regulierbaren oAdV auf der Kontrolle der Aktivität statt der Expression des essentiellen Genproduktes basiert.
In the present study four fusion proteins (ME, MEM, EM and ENLSM) were developed by fusing a mutated hormone-binding domain (HBD) of murine estrogen receptor (Mer) with the adenoviral E1A (E1ApRB) deleted in the pRB-binding site. A systematic characterisation of these fusion proteins showed that all constructs retain the functions of the native E1A in a tamoxifen (Tam) and hydroxy-tamoxifen (OHT) dependant manner. Based on these promising results four lung specific Tam-dependant oncolytic adenoviruses (Tam-oAdV) termed Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM and Ad.ENLSM were then constructed in which the coding cDNAs for ME, MEM, EM and ENLSM under control of the SP-B Promotor were respectively inserted in E1-Region of E1/E3-deleted AdV-Genom. Ad.MEM and Ad.ENLSM showed a higher regulation capacity compared to Ad.EM. However Ad.EM displayed the best replication and oncolytic efficiency. The construct Ad.ME was less efficient for both regulation and oncolysis. In mice bearing subcutan lung adenocarcinoma xenografts and infected with Ad.EM or Ad.ENLSM the tumor growth was significantly reduced after treatment with Tam. However, the Tam-dependant regulation of tumor growth was inefficient in vivo. The combination of Tam-oAdV with the tTS resulted in tighter regulation of viral replication. In further investigations the trans-complementation of a FasL-expressing Ad vector (Ad5Tight1-FasL) by Ad.MEM and Ad.ENLSM results in a Tam-dependant synergistic effect on the oncolytic efficient of Tam-oAdV in H441 cell. Taken together a new generation of pharmacologically controlled oAdV was developed whose principle of regulation is based on the control of viral gene products´s activities and not on their expression.