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Ribozyme zur Genregulation in Aspergillus giganteus

Müller, Dirk

Hyphenpilze sind wirtschaftlich bedeutende Produzenten von primären und sekundären Metaboliten. Durch gerichtete Beeinflussung von Stoffwechselflüssen (Metabolic Engineering) kann die Produktbildung in industriell genutzten Pilzstämmen verbessert bzw. die Produktion von unerwünschten Nebenprodukten vermindert werden. Häufig sind Produktbildungs- und Wachstumsphase zeitlich getrennt. Es ist daher oftmals notwendig, die nötigen Eingriffe in den Pilzstoffwechsel zeitlich steuerbar zu gestalten. Ein viel versprechendes Werkzeug für diesen Zweck könnte die posttranskriptionale Regulation der Genexpression mit Hilfe der Ribozymtechnologie darstellen. Da es bisher keine Beispiele für die Verwendung von Ribozymen in Hyphenpilzen gibt, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Modellsystem (GUS-Reportersystems aus E. coli, uidA Gen unter der Kontrolle des pah4-Promoter) etabliert, mit dessen Hilfe die in vivo Aktivität von Ribozymen in dem Hyphenpilz Aspergillus giganteus untersucht werden konnte. Basierend auf einer in silico Strukturvorhersage der uidA RNA wurden sieben Ribozym Zielsequenzen ( GUC ) identifiziert. Von den anschließend entwickelten, im Bereich der Zielsequenzen bindenden Ribozyme wurden unterschiedliche Versionen generiert, um u.a. den Einfluss der Länge der bindenden Arme auf die Ribozymaktivität zu testen. Die Aktivität der unterschiedlichen Ribozyme und der Einfluss der Größe des Substrats auf die Ribozym-katalysierte Spaltung wurde durch die Verwendung unterschiedlich großer 5 -Fragmente der uidA mRNA in vitro untersucht. Anschließend wurden Ribozym-kodierende Plasmide nach A. giganteus transferiert und über das Reportersystem auf RNA und Proteinlevel deren Funtkionalität gezeigt. Alle in silico entwickelten Ribozyme reduzierten die Reporteraktivität in vivo. Eine vollständige Repression der GUS-Aktivität erreichten Ribozyme mit Zielsequenzen im 5 -Bereich der uidA mRNA, was auf eine besonders gute Zugänglichkeit dieser Region hinweist. Ribozyme mit symmetrischen Bindungsarmen zeigten in vivo eine höhere Aktivität als Ribozyme mit asymmetrischen Bindungsarmen. Die Untersuchung der in vivo Spaltprodukte zeigte neben den erwarteten auch unerwartete Abbauprodukte, welche in einer DotPlot Analyse auf die Restriktion alternativer Zielsequenzen zurückgeführt werden konnten. Die vorliegende Arbeit ist die erfolgreiche Anwendung von Ribozymen zur Genregulation in Hyphenpilzen. Die Ribozymtechnologie ist deshalb als Werkzeug für das Metabolic Engineering in industriell und auch wissenschaftlich interessanten Hyphenpilzen denkbar, und eine interessante Alternative zu den konventionellen Methoden.