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Genetic code expansion for ageing study

optical control FtsZ self-organization by site-specific incorporation of photocaged Tyrosine analog

Sun, Huan

Halogen modified Tyr analogs (HMYs) are typical products of the Tyr residue oxidation in proteins. Their occurrence may lead to destabilized protein integrity and functions, ultimately contributing to ageing processes[1]. In this study, I investigated the effects of the HMYs on model proteins. The samples were produced by exploiting the genetic code expansion methodology. The eukaryotic gene replication associated histone protein (human histone 3, hH3) and bacterial cell division related protein (filamenting temperature-sensitive mutant Z, FtsZ) were taken as two model systems to address the effects of the Tyr halogenation onto protein structure, activity, polymerization, and assembly patterns. The synthetic halogenation aimed to mimic oxidative processes occurring in cells in the course of ageing. Firstly, aaRSs derived from Methanocaldococcus jannaschii tyrosyl-tRNA synthetase (MjTyrRS) were selected to site-specifically incorporate HMYs into target proteins. The specificity of the synthetases were attained via the one-round positive selection procedure. Then, it was aimed to study the structure and tetramer assembly changes in homogeneously halogenated histone protein. For this reason, the genetic encoding of HMYs was applied to produce homogeneously and site-specifically halogenated recombinant histones for the first time. Compared to the wild type (WT) human histone 3 (hH3), halogenation at position Y54 of hH3 altered the protein structure, as evidently seen in the circular dichroism spectra and absorbance profiles. Furthermore, hH3 bearing 3-bromotyrosine (BrY), 3-chlorotyrosine (ClY), and 3,5-diiodotyrosine (I2Y) showed decreased tetramer assembly efficiency, while the presence of 3,5-dichlorotyrosine (Cl2Y), 3,5-dibromotyrosine (Br2Y), and 3-iodotyrosine (IY) demonstrated an opposite effect. These results imply that halogenation at Y54 may cause aberrant chromatin regulation thereby promoting the development of human diseases. Here, our results provide a mechanistic underpinning for human ageing phenomena associated with the halogenation of Y54 in hH3. Next, HMYs were site-specifically incorporated into FtsZ protein. This enabled a study of alterations in protein activity, polymerization, and self-organization, ultimately underlying bacterial ageing processes. Halogenation of the FtsZ chimera protein (FtsZ-YFP-mts) was introduced at the Y222 position, which is a key residue for polymerization. The proteins were produced by site-specific incorporation of HMYs via selected aaRSs. I found that the presence of HMYs in the sequence suppressed the GTPase activity and polymerization rate of FtsZ, suggesting that halogenation should also compromise the dynamics of the parent protein. Furthermore, we investigated self-organization patterns of FtsZ-YFP-mts bearing HMYs in vitro. The proteins containing ClY, BrY, Br2Y, and I2Y formed heterogenous rings equipped with shifted ring size compared to the WT. I also demonstrated that deficient GTPase activity of FtsZ chimera protein bearing ClY, BrY, Br2Y, and I2Y correlated with the decreased treadmilling velocities of rotational vortices. Remarkably, FtsZ containing Cl2Y and IY self-assembled into highly meshed filament patterns, indicating that these modifications blocked the Z-ring formation. Moreover, the dynamic ring formation of WT FtsZ chimera gradually disappeared by mixing with FtsZ-YFP-mts bearing Cl2Y or IY containing protein at certain ratios, implying that halogenated protein interfered with the self-organization of the WT protein monomers into protofilaments, and further inhibited the Z-ring formation. These findings thus demonstrated that halogenation of FtsZ at position Y222 compromised its dynamics, resulting in aberrant self-organization pattern, suggesting the harmful influence of halogenation on the cell division process, leading to cell growth arrest. Therefore, halogenation on hH3 and FtsZ at specific positions aberrantly altered their structures, activities, and assemblies, indicating that halogenation of the model proteins should lead to cell dysfunction, ultimately contributing to ageing process. Our study will help to improve understanding of the ageing process, and will contribute to the development of diagnostic methods and therapeutic interventions for patients in the future. A universal gain-of-function approach for spatiotemporal control protein activity to reconstitute functional modules of biological systems in vitro is crucial to elucidate the dynamic biological processes. Here, I developed a genetically encoded decaging strategy that enables light activation of FtsZ from the bottom-up. Site-specific incorporation of photocaged amino acid into the functional position of FtsZ temporally abolished its function, which can be rapidly removed upon irradiation, re-activating FtsZ. Precise spatiotemporal control FtsZ ring formation pattern with light allows me to dissect the dynamic bacterial cell division process in vitro.
Halogenmodifizierte Tyr-Analoga (HMYs) sind typische Produkte der Oxidation von Tyr-Resten in Proteinen. Ihr Auftreten kann zu einer Destabilisierung der Proteinintegrität und -funktionen führen und letztendlich zu Alterungsprozessen führen [1]. In dieser Studie habe ich untersucht die Auswirkungen der HMYs auf Modellproteine. Die Proben wurden unter Verwendung der genetischen Code-Erweiterungsmethode hergestellt. Das mit der eukaryotischen Genreplikation assoziierte Histonprotein (menschliches Histon 3, hH3) und das mit der bakteriellen Zellteilung zusammenhängende Protein (filamentierende temperaturempfindliche Mutante Z, FtsZ) wurden als zwei Modellsysteme benutzt, um die Auswirkungen der Tyr-Halogenierung auf die Proteinstruktur, Aktivität, Polymerisations- und Asemblierungsprozess. Die synthetische Halogenierung sollte oxidative Prozesse im Alterungsprozess der Zellen nachahmen. Zunächst wurden von Methanocaldococcus jannaschii-Tyrosyl-tRNA-Synthetase (MjTyrRS) abgeleitete aaRS ausgewählt, um HMYs ortsspezifisch in Zielproteine einzubauen. Die Spezifität der Synthetasen wurde über das Einrunden-Positivselektionsverfahren (one-round positive selection procedure) erreicht. Anschließend habe ich Struktur- und Tetramerssemblierungs Änderungen in homogen halogeniertem Histonprotein untersucht. Aus diesem Grund wurde die genetische Kodierung von HMYs zum ersten Mal angewendet, um homogene und ortsspezifische halogenierte rekombinante Histone herzustellen. Im Vergleich zum humanen Wildtyp (WT) -Histon 3 (hH3) veränderte die Halogenierung an Position Y54 von hH3 die Proteinstruktur, wie aus den Circular Dischroismus Spektern und den Absorptionsprofilen ersichtlich ist. Darüber hinaus zeigte hH3 mit 3-Bromtyrosin (BrY), 3-Chlortyrosin (ClY) und 3,5-Diiodtyrosin (I2Y) eine verminderte Tetramer-Assemblierungseffizienz, während das Vorhandensein von 3,5-Dichlortyrosin (Cl2Y), 3,5- Dibromotyrosin (Br2Y) und 3-Iodotyrosin (IY) in Strukturen zeigten einen gegenteiligen Effekt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Halogenierung an Y54 eine aberrante Chromatinregulation hervorrufen kann, wodurch die Entwicklung menschlicher Krankheiten gefördert wird. Hier liefern unsere Ergebnisse eine mechanistische Grundlage für menschliche Alterungsphänomene, die mit der Halogenierung von Y54 in hH3 verbunden sind. Als nächstes wurden HMYs ortsspezifisch in das FtsZ-Protein eingebaut. Dies ermöglichte eine Untersuchung der Veränderungen der Proteinaktivität, der Polymerisation und der Selbstorganisation, die letztendlich den Alterungsprozessen der Bakterien zugrunde liegen. Die Halogenierung des FtsZ-Chimären-Proteins (FtsZ-YFP-mts) wurde an der Y222-Position eingeführt, die ein Schlüsselrest für die Polymerisation ist. Die Proteine wurden durch ortsspezifischen Einbau von HMYs über ausgewählte aaRSs hergestellt. Ich habe gefunden, dass das Vorhandensein von HMYs in der Sequenz die GTPase-Aktivität und die Polymerisations-Geschwidnigheit von FtsZ unterdrückte, was nahelegte, dass die Halogenierung auch die Dynamik des Parentproteins beeinträchtigen sollte. Darüber hinaus habe ich in vitro untersucht die Selbstorganisationsmuster von FtsZ-YFP-mts, die HMYs tragen,. Die Proteine, die ClY, BrY, Br2Y und I2Y enthielten, bildeten heterogene Ringe, die mit einer im Vergleich zur WT verschobenen Ringgröße ausgestattet waren. Ich habe auch gezeigt, dass eine mangelnde GTPase-Aktivität des ClY, BrY, Br2Y und I2Y tragenden FtsZ-Chimärenproteins mit den verringerten Laufbandgeschwindigkeiten von Rotationswirbeln korreliert. Bemerkenswert ist, dass FtsZ, das Cl2Y und IY enthält, sich selbst zu vermaschten Filamentsmustern zusammenlagert, was darauf hinweist, dass diese Modifikationen die Bildung des Z-Rings blockierten. Darüber hinaus verschwand die dynamische Ringbildung der WT-FtsZ-Chimäre allmählich durch Mischen mit FtsZ-YFP-mts, die Cl2Y oder IY-haltiges Protein in bestimmten Verhältnissen enthielten, was impliziert, dass das halogenierte Protein die Selbstorganisation der WT-Proteinmonomere in Protofilamente störte, und weiter hemmte die Z-Ring-Bildung. Diese Ergebnisse zeigten somit, dass die Halogenierung von FtsZ an Position Y222 seine Dynamik beeinträchtigte, was zu einem abweichenden Selbstorganisationsmuster führte, was auf den schädlichen Einfluss der Halogenierung auf den Zellteilungsprozess hindeutet, was zum Stillstand des Zellwachstums führt. Daher veränderte die Halogenierung von hH3 und FtsZ an bestimmten Positionen ihre Strukturen, Aktivitäten und Anordnungen auf abweichende Weise, was darauf hindeutet, dass die Halogenierung der Modellproteine zu einer Funktionsstörung der Zellen führen und letztendlich zum Alterungsprozess beitragen sollte. Unsere Studie wird dazu beitragen, das Verständnis des Alterungsprozesses zu verbessern und in Zukunft diagnostische Methoden und therapeutische Ansatze für Patienten zu entwickeln. Ein in vitro universeller Gain-of-Function Ansatz für die raumzeitliche Kontrollproteinaktivität zur Wiederherstellung von Funktionsmodulen biologischer Systeme ist von entscheidender Bedeutung, um die dynamischen biologischen Prozesse aufzuklären. Hier habe ich eine genetisch codierte Decaging-Strategie entwickelt, die die Aktivierung von FtsZ durch Licht von unten nach oben ermöglicht. Der ortsspezifische Einbau von photogefärbter Aminosäure in die funktionelle Position von FtsZ hob zeitweise seine Funktion auf, die bei Bestrahlung schnell entfernt werden kann, wodurch FtsZ reaktiviert wird. Präzise räumlich-zeitliche Kontrolle Das FtsZ-Ringbildungsmuster mit Licht ermöglicht es mir, den dynamischen bakteriellen Zellteilungsprozess in vitro zu analysieren.