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Computational studies on the dynamical properties of phytochromes

Battocchio, Giovanni

Phytochromes are superfamily of bistable photoreceptor molecules found in several organisms, such as plants, bacteria, algae and fungi. They serve as light sensors, mainly detecting red and far red light, governing a range of functions, such as seed germination, greening, stem extension, and flowering in plants. Due to their important role in several organism they have been studied for decades, tough their full mechanism of action remains elusive. In this work we investigated the dynamical properties of phytochromes by means of computational methods. Furthermore we extended the studies to the vibrational properties of the light sensitive chromophore, an open tetrapyrrol bilin, contained inside the phytochromes. In the first chapter of this work we start with a general description of phytochromes and their structure, including peculiar features such as a knot like structure connecting two domains. We give a brief exposition of differences and varieties of phytochromes found in plants, bacteria and other organism based on their light sensitivity and photocycle behaviour. We discuss the known conformational changes that happen during the photocycle, both in the chromophore and in the protein scaffold. In the second chapter we briefly summarise the theory behind the computational methods used, from molecular dynamic (MD) to quantum mechanic (QM). We outlined the foundations of MD, a computational method widely employed for the studify of large biomolecules such as complex proteins. We give a short exposition on how to include the effect of the environment, with whom the protein interacts during the simulations. Of the many algorithm developed since the introduction of MD method, we list the ones employed in our simulations. We continue then with a section on two methods we employed developed to improve conformational sampling, an issue that affects all MD simulations and has been tackled by many researcher over the years. In the last part we give a description of the employed QM/MM method adopted to evaluate vibrational properties of the chromophore, whose results can then be compared with experimental results. In the third chapter we include a summary of the computational details of our calculations. Beginning with how models are prepared, a starting step sometimes overlooked, but that has deep repercussion on all the simulations that follow. We also give a brief exposition of the used softwares and their capabilities, we then conclude with a section on analysis tools. A proper analysis of the results is as or even more important than the simulations itself, so the choice of the adequate analysis method that better correlates trajectories with actual physical properties, is of greatest importance for the final interpretation of the vast amount of gathered data. The fourth chapter should be the most interesting for the reader, since it contains the highlights of the results obtained during this PhD period. Results are grouped by system and their observed dynamical behaviour, starting with arguably the most studied phytochrome, Deinocccus radiodurans(DrBph), followed by Agp2 from Agrobacterium tumefaciens, Xantomonas campestris (XccBph) phytochromes and lastly GAF-3, a cyanobacteriochrome derived from Synechocystis sp. PCC6803. Thanks to the the use of enhanced sampling methods, we were able to study the dynamics of these phyotchromes in a wider variety of conformations and relating them to some specific structural features. Example is the effect of simulating the monomer versus the naturally occurring dimer in solution, or the deletion of a linker knot from the protein scaffold, in DrBph. These enhanced methods made possible to sample secondary structural transitions in Agp2, a phenomenon that would otherwise require order of magnitudes longer conventional MD. In addition was possible to assess the stability of different dimer construct on the longer time scale and determine if one conformation is more or less stable than another one in XccBph, a question that has always driven curiosity, since most of naturally occurring phytochromes appears as parallel dimer, but few physiological functional ones adopt an antiparallel configuration. Other computational methods were adopted, including constant pH calculations, giving accurate pKa values predictions for key residues in the chromophore vicinity and their most likely protonation states in Agp2. This is turn influences the correspondent MD sampling, giving a better and more physiologically accurate representation of the dynamic proton interchange between residues happening in the protein. Finally the results of QM/MM calculations on GAF-3, an interesting red-green photo-switch, aimed to reproduce and help interpret experimental spectra and to link spectra to conformations.
Phytochromen sind eine Superfamilie von bistabilen Photorezeptormolekülen, die in verschiedenen Organismen wie Pflanzen, Bakterien, Algen und Pilzen vorkommen. Sie dienen als Lichtsensoren, die hauptsächlich rotes und fernes rotes Licht erkennen und eine Reihe von Funktionen steuern, wie z. B. die Keimung von Samen, das Ergrünen, die Ausdehnung des Stängels und die Blüte bei Pflanzen. Aufgrund ihrer wichtigen Rolle in verschiedenen Organismen werden sie seit Jahrzehnten erforscht, obwohl ihr vollständiger Wirkmechanismus noch immer schwer zu verstehen ist. In dieser Arbeit haben wir die dynamischen Eigenschaften von Phytochromen mit Hilfe von Berechnungsmethoden untersucht. Darüber hinaus haben wir die Untersuchungen auf die Schwingungseigenschaften des lichtempfindlichen Chromophors, eines offenen Tetrapyrrol-Bilins, das im Inneren der Phytochrome enthalten ist, ausgeweitet. Im ersten Kapitel dieser Arbeit beginnen wir mit einer allgemeinen Beschreibung der Phytochrome und ihrer Struktur, einschließlich besonderer Merkmale wie einer knotenartigen Struktur, die zwei Domänen verbindet. Wir geben eine kurze Darstellung der Unterschiede und Varietäten von Phytochromen, die in Pflanzen, Bakterien und anderen Organismen gefunden werden, basierend auf ihrer Lichtempfindlichkeit und ihrem Verhalten im Photozyklus. Des Weiteren diskutieren wir die bekannten Konformationsänderungen, die während des Photozyklus stattfinden, sowohl im Chromophor als auch im Proteingerüst. Im zweiten Kapitel fassen wir kurz die Theorie hinter den verwendeten Berechnungsmethoden zusammen, von der Molekulardynamik (MD) bis zur Quantenmechanik (QM). Unter anderem skizzieren wir die Grundlagen der MD, einer Berechnungsmethode, die häufig für die Untersuchung großer Biomoleküle wie komplexer Proteine eingesetzt wird und geben eine kurze Darstellung, wie man den Effekt der Umgebung, mit der das Protein während der Simulationen interagiert, einbezieht. Darüber hinaus listen wir von den vielen Algorithmen, die seit der Einführung der MD-Methode entwickelt wurden, die in unseren Simulationen verwendeten auf. Im weiteren Verlauf dieses Kapitels fahren wir mit einem Abschnitt über zwei von uns verwendete Methoden fort, die entwickelt wurden, um das Konformations-Sampling zu verbessern, ein Problem, das alle MD-Simulationen betrifft und im Laufe der Jahre von vielen Forschern angegangen wurde. Im letzten Teil beschreiben wir die eingesetzte QM/MM-Methode, die zur Auswertung der Schwingungseigenschaften des Chromophors verwendet wurde, deren Ergebnisse dann mit experimentellen Ergebnissen verglichen werden können. Im dritten Kapitel fassen wir die rechnerischen Details unserer Berechnungen zusammen. Wir beginnen damit, wie die Modelle vorbereitet werden. Dieser Anfangsschritt wird manchmal übersehen wird, hat aber tiefgreifende Auswirkungen auf alle folgenden Simulationen. Hierbei geben wir auch eine kurze Darstellung der verwendeten Software und ihrer Möglichkeiten und schließen dann mit einem Abschnitt über Analysewerkzeuge. Die Wahl der geeigneten Analysemethode, die die Trajektorien besser mit den tatsächlichen physikalischen Eigenschaften korreliert, ist daher von größter Bedeutung für die endgültige Interpretation der riesigen Menge an gesammelten Daten. Das vierte Kapitel dürfte für den Leser das interessanteste sein, da es die Höhepunkte der während dieser Promotionszeit erzielten Ergebnisse enthält. Die Ergebnisse sind nach Systemen und ihrem beobachteten dynamischen Verhalten gruppiert, beginnend mit dem wohl am besten untersuchten Phytochrom, Deinocccus radiodurans(DrBph), gefolgt von Agp2 aus Agrobacterium tumefaciens, Xantomonas campestris (XccBph) Phytochrome und schließlich GAF-3, ein Cyanobakteriochrom, das aus Synechocystis sp. PCC6803 stammt. Dank der Verwendung erweiterter Sampling-Methoden konnten wir die Dynamik dieser Phyotchrome in einer größeren Vielfalt von Konformationen un- tersuchen und sie mit einigen spezifischen strukturellen Merkmalen in Verbindung bringen. Ein Beispiel dafür ist der Effekt der Simulation des Monomers gegenüber dem natürlich vorkommenden Dimer in Lösung oder der Deletion eines Linkerknotens aus dem Proteingerüst, in DrBph. Diese verbesserten Methoden ermöglichten es, sekundärstrukturelle Übergänge in Agp2 zu untersuchen, ein Phänomen, für das sonst eine um Größenordnungen längere konventionelle MD erforderlich wäre. Außerdem war es möglich, die Stabilität verschiedener Dimerkonstrukte auf der längeren Zeitskala zu bewerten und zu bestimmen, ob eine Konformation mehr oder weniger stabil ist als eine andere in XccBph. Dies ist eine Frage, die schon immer das wissenschaftliche Interesse geweckt hat, da die meisten natürlich vorkommenden Phytochrome als parallele Dimere auftreten, aber nur wenige physiologisch funktionale eine antiparallele Konfiguration annehmen. Es wurden weitere Berechnungsmethoden angewandt, darunter Berechnungen mit konstantem pH-Wert, die genaue Vorhersagen der pKa-Werte für Schlüsselreste in der Nähe des Chromophors und ihrer wahrscheinlichsten Protonierungszustände in Agp2 liefern. Dies wiederum beeinflusst das entsprechende MD-Sampling, was eine bessere und physiologisch genauere Darstellung des dynamischen Protonenaustauschs zwischen den Resten im Protein ergibt. Schließlich wurden die Ergebnisse von QM/MM-Rechnungen an GAF-3, einem interessanten Rot-Grün-Photoschalter, vorgestellt, die darauf abzielen, experimentelle Spektren zu reproduzieren und zu interpretieren sowie Spektren mit Konformationen zu verknüpfen.