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Bioengineering aspects of microcarrier-based hMSC expansions in different single-use bioreactors
Jossen, Valentin
Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are a valuable cell source for the treatment of degenerative diseases. For the mass expansion of hMSCs, Single-use (SU) bioreactors in combination with microcarriers (MCs) represent a suitable solution. In the present thesis, different aspects of the MC-based expansion of hMSCs in different SU bioreactors were investigated. Special emphasis will be placed on the process engineering characterization of different SU bioreactors for the MC-based expansion of hMSCs. In the first case study, fundamental process engineering parameters (e.g., fluid flow patter) for two SU spinner flask types were predicted using classical, experimental methods and single and multiphase CFD models. Based on the predicted hydrodynamic stresses for different impeller speeds, including the suspension criteria (Ns1u, Ns1), cultivation studies were performed in order to establish the MC-based hMSC expansion process. Maximum peak cell densities of up to 8.7·105 cells/mL were achieved in both spinner flask types for Ns1u≤N≤Ns1 and for specific power inputs and mean hydrodynamic stresses between 0.33 and 1.12W/m3 and between 4.0 and 6.6·10−3 Pa, respectively. In the second case study, the geometry of the stirred benchtop scale UniVessel SU 2L bioreactor was optimized and compared with its standard version and the Mobius CellReady 3L. Based on an in silico optimization study, nine bioreactor geometries were investigated with respect to their suspension characteristics and occurring shear stresses. It was demonstrated that, by reducing the off-bottom clearance and modifying the impeller blade angle from 30◦ to 45◦, the impeller speeds and associated power inputs respectively shear stresses required for Ns1u can be reduced by a factor of 3. Due to the reduced hydrodynamic stresses, significantly lower doubling times (18.6-22.3 h) and higher cell densities (7.2·105 hASCs/mL, 5.3·105 hBM-MSCs/mL) of adipose tissue-derived stromal/stem cells (hASCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) were achieved compared to the standard UniVessel SU 2L and the Mobius CellReady 3L. In the third case study, the MC-based hMSC expansion process was scaled up to the BIOSTAT CultiBag STR 50L using Ns1u as a scale-up criterion. Based on the obtained hydrodynamic stresses at Ns1u and their comparison with the SU bioreactors at small and benchtop scale, process parameters for the in vitro expansions were defined. In so doing, clinically-relevant cell numbers of up to 1.03·1010 for hASCs and up to 1.28·1010 for hBM-MSCs were achieved. The subsequent cell biological analysis demonstrated that the cells maintained their stem cell specific characteristics. In the fourth case study, it was explored whether the MC-based expansion process established in the stirred SU bioreactors can be transferred to wave-mixed bioreactors using the definition of Ns1u. For this purpose, a multiphase CFD model was established that provided reliable fluid flow predictions. Based on the obtained process engineering data and the information from the experimental suspension studies, a rocking angle of 4◦, a rocking rate of 31 rpm, and a working volume of 1.5 L was defined for a first proof-of-concept cultivation in the BIOSTAT CultiBag RM 2L which resulted in an expansion factor of 6.59.
Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) besitzen ein grosses Potential für die Behandlung degenerativer Erkrankungen. Für die Massenexpansion von hMSCs stellen Einwegbioreaktoren in Kombination mit Microcarriern (MC) eine geeignete Lösung dar. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Aspekte der MC-basierten Kultivierung von hMSCs in SU Bioreaktoren untersucht. Besonderes Augenmerk wurde hierbei auf die verfahrenstechnische Charakterisierung verschiedener SU Bioreaktoren für die MC-basierte hMSC Expansion gelegt. In der ersten Fallstudie wurden grundlegende verfahrenstechnische Parameter (z.B. Fluidströmung) für zwei SU Spinnerflachen mit experimentellen Methoden sowie ein- und mehrphasigen CFD-Simulationen untersucht. Basierend auf den ermittelten hydrodynamischen Belastungen für unterschiedliche Rührerdrehzahlen, einschließlich der Suspendierkriterien (Ns1u, Ns1), wurden Kultivierungsuntersuchungen durchgeführt. Maximale Zelldichten von bis zu 8.7·105 Zellen/mL wurden in beiden Spinnerflaschen für Ns1u ≤ N ≤ Ns1 und für spezifische Leistungseinträge und mittlere Scherbelastungen zwischen 0.33 und 1.12 W/m3 beziehungsweise zwischen 4.0 und 6.6·10−3 Pa erreicht. In der zweiten Fallstudie wurde die Geometrie des UniVessel SU 2L optimiert und mit der Standardausführung sowie dem Mobius CellReady 3L verglichen. Basierend auf einer in silico Optimierungsstudie wurden neun Reaktorgeometrien hinsichtlich ihrer Suspendierseigenschaften sowie der auftretenden Scherbelastungen untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass durch die Reduzierung des Rührerabstandes zum Reaktorboden und durch die Erhöhung des Rühreranstellwinkels von 30◦ auf 45◦ die für Ns1u erforderlichen Rührerdrehzahlen und die damit verbundenen spezifischen Leistungseinträge und Scherbelastungen um den Faktor 3 reduziert werden konnten. Aufgrund der reduzierten hydrodynamischen Belastungen wurden signifikant niedrigere Verdopplungszeiten (18.6-22.3 h) sowie höhere Zelldichten (7.2·105 hASCs/mL, 5.3·105 hBM-MSCs/mL) für humane mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (hASC) und dem Knochenmark (hBM-MSC) im Vergleich zum Standard UniVessel SU 2 L und dem Mobius CellReady 3 L erreicht. In der dritten Fallstudie wurde der MC-basierte hMSC-Expansionsprozess auf den BIOSTAT CultiBag STR 50L übertragen, wobei Ns1u als Scale-up Kriterium verwendet wurde. Basierend auf den ermittelten hydrodynamischen Bedingungen bei Ns1u und deren Vergleich mit den SU Bioreaktoren im Klein- und Labormaßstab wurden Prozessparameter für die in vitro Expansion festgelegt. Hierbei wurden klinisch relevante Zellzahlen von bis zu 1.03·1010 für die hASCs und bis zu 1.28·1010 für die hBM-MSCs erreicht. Die anschließende zellbiologischen Untersuchungen zeigten, dass die Zellen ihre stammzellspezifischen Eigenschaften beibehielten. In der vierten Fallstudie wurde untersucht, ob der etablierte MC-basierte Expansionsprozess auf wellendurchmischte Bioreaktoren übertragen werden kann. Zu diesem Zweck wurde ein mehrphasiges CFD-Modell erstellt, dass eine zuverlässige Beschreibung der Strömungszustände lieferte. Basierend auf dem Model wurden zeitabhängige hydrodynamische Belastungen und spezifische Leistungseinträge für Ns1u berechnet. Die anschliessende Proof-of-Concept Kultivierung im BIOSTAT CultiBag RM 2L bei 4° und 31 rpm resultierte in einem Expansionsfaktor von 6.59.
