Thumbnail Image

Untersuchungen an humanen und murinen Serumproben zu freiem Zink als Biomarker und zum Einfluss der Spurenelement-Versorgung auf altersbedingte Veränderungen des Immunsystems

Alker, Wiebke

Zink ist ein essentielles Spurenelement (SpE). Bei einem Mangel können schwerwiegende gesundheitliche Auswirkungen auftreten. Aktuellen Schätzungen zufolge sind etwa 20% der weltweiten Bevölkerung von dem Risiko einer Zink-Unterversorgung betroffen, dabei bestehen jedoch geografische Unterschiede. Für die Bevölkerung in Entwicklungs- und Schwellenländern ist das Risiko einer Zink-Unterversorgung wesentlich höher als für die in Industrieländern. In letzteren sind hauptsächlich bestimmte Bevölkerungsgruppen betroffen, darunter alte Personen. In verschiedenen Studien wurde mit zunehmendem Alter eine Abnahme des Gesamtzinkgehaltes des Serums gezeigt. Zur Behandlung eines Zinkmangels bedarf es zunächst einer entsprechenden Diagnose. Bisher etablierte Biomarker sind gut geeignet, um den Zinkstatus von Populationen zu erfassen. Sie weisen jedoch Mängel auf, wenn es um den Zinkstatus von Individuen geht, sodass für diesen Anwendungsbereich weiterhin Forschungsbedarf besteht. In diesem Zusammenhang wurde die freie Zinkkonzentration im Serum als vielversprechender Biomarker erwogen. Als freies Zink wird der Zinkanteil beschrieben, der nicht fest an Proteine gebunden vorliegt, sondern in Wechselwirkung steht mit niedermolekularen Liganden. Es gibt Hinweise darauf, dass das freie Zink den biologisch aktiven Anteil an Zink darstellt, der zur Interaktion mit Zellen zur Verfügung steht. Daher könnte die freie Zinkkonzentration im Serum besser geeignet sein, den Zinkstatus eines Individuums widerzuspiegeln, als die gesamte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher ein Fluoreszenzsonden-basierter Assay zur Bestimmung der freien Zinkkonzentration in humanen und murinen Serumproben etabliert. Die freie Zinkkonzentration der untersuchten Serumproben lag im piko- bis nanomolaren Bereich. In den Seren der verschiedenen untersuchten Probengruppen zeigte sich zwischen der freien und der gesamten Zinkkonzentration kein linearer Zusammenhang oder nur ein schwach linearer. In mehreren Probengruppen war die freie Zinkkonzentration der Seren von Frauen bzw. weiblichen Mäusen signifikant niedriger, als die der Seren von Männern bzw. männlichen Mäusen. Beim Gesamtzinkgehalt der Serumproben trat hingegen kein geschlechtsspezifischer Unterschied auf. Die ermittelten Daten deuten darauf hin, dass es sich bei der freien Zinkkonzentration im Serum um einen Parameter handelt, der unabhängig ist vom Gesamtzinkgehalt im Serum. Anhand der bisherigen Daten kann jedoch noch keine Aussage darüber getroffen werden, ob die freie Zinkkonzentration im Serum als Biomarker geeignet ist den Zinkstatus von Individuen widerzuspiegeln. Dennoch scheint es vielversprechend, diesen Parameter sowohl hinsichtlich seiner Eignung als Biomarker, als auch seiner physiologischen Relevanz weiterführend zu untersuchen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Proben einer Fütterungsstudie mit Mäusen analysiert. Ziel der Studie war es, den Einfluss der SpE-Versorgung auf altersbedingte Veränderungen der SpE-Homöostase und SpE-abhängiger physiologischer Prozesse zu untersuchen. Hierfür erhielten erwachsene und alte Mäuse entweder eine adäquate SpE Versorgung, oder eine, die für mehrere SpE gleichzeitig (Zink, Selen, Kupfer, Eisen) suboptimal war, oder eine altersadaptierte, die einen erhöhten Gehalt an Zink und Selen aufwies. Mit letzterer sollte untersucht werden, ob altersbedingten Veränderungen entgegengewirkt werden kann, indem eine erhöhte Versorgung mit den SpE erfolgt, deren Gehalt im Serum mit zunehmendem Alter abnimmt. Als ein zentrales Organ der Zink Homöostase wurde die Leber untersucht. Dafür wurde ein Fluoreszenzsonden-basierter Assay zur Bestimmung der freien Zinkkonzentration in homogenisierten murinen Lebergewebeproben etabliert. Die damit ermittelten Daten zeigen, dass die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe tendenziell die Zink-Versorgung der Mäuse widerspiegelt und die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe weiblicher Mäuse signifikant höher ist als die im Lebergewebe männlicher. Beim Gesamtzinkgehalt des Lebergewebes traten keine derartigen Effekte der Zink-Versorgung oder des Geschlechts auf. Das Alter der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe. Die Funktionsfähigkeit des Immunsystems ist von Zink abhängig und unterliegt zudem altersbedingten Veränderungen. Als Bestandteil des Immunsystems wurden daher isolierte Splenozyten untersucht. Es wurde der prozentuale Anteil an B-Zellen, T Helferzellen, zytotoxischen T-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen an den isolierten Splenozyten bestimmt, die zelluläre freie Zinkkonzentration der verschiedenen Zelltypen, sowie der relative Gehalt der pro- bzw. anti-inflammatorischen Zytokine Interleukin (IL) 2, IL-10, IL 17, Interferon-γ und Tumornekrosefaktor-α im Überstand nach Stimulation mit Phytohämaglutinin (PHA). Es zeigte sich altersbedingt eine Abnahme des Anteils an T Helferzellen, ein Anstieg des Anteils an dendritischen Zellen, eine Abnahme der zellulären freien Zinkkonzentration von B-Zellen und dendritischen Zellen sowie eine Zunahme des relativen IL-10 Gehaltes im Überstand nach Stimulation der isolierten Splenozyten mit PHA. Die altersadaptierte SpE Versorgung, mit einem erhöhten Zink- und Selengehalt, hat diesen beobachteten altersbedingten Veränderungen des Immunsystems nicht entgegengewirkt. Dies deutet darauf hin, dass die zugrunde liegenden Mechanismen nicht durch eine erhöhte ernährungsbedingte Zink- und Selenzufuhr moduliert werden können.
Zinc is an essential trace element (TE). Insufficient supply can lead to severe health effects. According to current estimations, about 20% of the world’s population are at risk of an insufficient zinc supply. Thereby geographic differences occur. In developing countries and emerging countries the population is at substantially higher risk of zinc deficiency, compared to industrial countries. In the latter, mostly people from specific population groups are at risk. Among them are elderly people, as studies have shown a decrease in the total zinc concentration of the serum with increasing age. To treat zinc deficiency, it hast to be diagnosed first. Biomarkers established so far are well suited to evaluate the zinc status of populations. However, they have their limitations when it comes to individuals. A good biomarker for this application area is still missing. In this context, the serum free zinc concentration has been suggested as a possible biomarker for the zinc status of individuals. The term free zinc describes the zinc pool that is loosely bound to low molecular weight fractions. Data in the literature implictates that free zinc represents the zinc that is biologically active and available for interaction with cells. Hence, the serum free zinc concentration might be a better parameter to reflect an individual’s zinc status than the total zinc concentration. Therefore, in the present work a fluorescent-probe based assay was established for determining the free zinc concentration in human and murine serum samples. The determined free zinc concentrations of the analyzed serum samples were in the pico- to nanomolar range. The free and total zinc concentrations in the sera of the different sample-groups analyzed either showed no linear correlation or a weak linear correlation. In several sample-groups analyzed, the free zinc concentration in sera from females was significantly lower than in sera from males. The data obtained support the meaning of the serum free zinc concentration as an independent parameter besides the total zinc concentration. However, based on the current data it cannot be evaluated yet, if the free zinc concentration in serum is a well-suited biomarker for an individual’s zinc status. Still it seems promising to further investigate this parameter, with regard to its suitability as a biomarker as well as its physiological relevance. In the context of the present work, samples from a feeding study with mice were analyzed. The aim of the study was to investigate the influence of TE-supply on age-related alterations in TE-homeostasis and TE-dependent physiological processes. Adult and old mice were treated with a TE-supply either adequate, suboptimal in several TEs (zinc, selenium, copper, iron) simultaneously or age-adjusted. The latter had an elevated content of zinc and selenium and aimed to investigate, whether age-related alterations can be prevented by an elevated supply of TEs, whose serum concentration decreases with increasing age. As a central organ of the body’s zinc-homeostasis, the liver was examined. For this, a fluorescent-probe based assay was established for determining the free zinc concentration in homogenized murine liver tissue. A tendency of the free zinc concentration in the liver tissue to reflect the zinc-supply of the mice was shown. In addition, the free zinc concentration in liver tissue samples from female mice was significantly higher than in samples from male mice. The total zinc content of the liver tissue showed no such effects of zinc supply or sex. The age of the mice did not affect the free zinc concentration of the liver tissue. The functionality of the immune system is dependent on zinc, in addition shows age-related alteration. Therefore, as part of the immune system, isolated splenocytes were examined. The percentage of B-cells, T helper cells, cytotoxic T-cells, macrophages and dendritic cells was determined, as well as the respective cellular free zinc concentration and the relative content of several pro- and anti-inflammatory cytokines (interleukin (IL)-2, IL-10, IL-17, interferon-γ and tumor necrosis factor α) in the supernatant after stimulation with phytohaemagglutinin (PHA). A decrease in the percentage of T-helper cells, an increase in percentage of dendritic cells, a decrease in the cellular free zinc concentration of B-cells and dendritic cells as well as an increase in relative IL-10 content in the supernatant after stimulation with PHA was shown in relation to age. The age-adjusted TE-supply showed no effect on these age-related alterations of the immune system. This implicates that the underlying mechanisms are not modulated by an enhanced nutritional supply of zinc and selenium.