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Powering biocatalytical reactions with hydrogen

Al-Shameri, Ammar

H2 -driven cofactor regeneration is cheap, 100% atom-efficient, and has been applied in various biotechnological approaches both in vivo and in vitro. To date, H2-driven cofactor regeneration has been applied only in biocatalytic reactions involving NADH. H2-driven cofactor regeneration has also never been employed in multi-enzymatic cascades or for other cofactors besides NADH. In this work, the application of H2 to drive multi-enzymatic cascades and biocatalytical redox reactions involving cofactors other than NADH was demonstrated. The vital key for achieving this was the application of the O2-tolerant NAD+-hydrogenase (SH) from Ralstonia eutropha H16. Firstly, the efficiency of SH in reducing flavins was demonstrated for both FMN and FAD. The SH was then coupled with the “old yellow enzyme” (TsOYE) for the H2-driven reduction of enoates, yielding up to 22 mM of product. The O2-tolerance of SH was then demonstrated by coupling SH with styrene monooxygenase (StyA), which used O2 as a co-substrate to drive the epoxidation of styrene, yielding 1 mM of styrene oxide. The H2-driven flavin regeneration was used to generate H2O2 by uncoupling the reduced FMN with O2. The H2O2 produced was then used as a substrate for the unspecific peroxygenase to hydroxylate organic compounds, yielding up to 4.8 mM of hydroxylated product. Secondly, a novel multi-enzymatic cascade was designed to synthesize methylated N-heterocycles from diamines. N-heterocycles are valuable precursors in the synthesis of various pharmaceuticals. The cascade consisted of an engineered putrescine oxidase (PuOE203G), an imine reductase (IRED), and a NADP+-reducing hydrogenase (SHE341A/S342R). Methylated N-heterocycles were synthesized, with up to 97% conversion yield and >73% ee. The used H2-based regeneration system proved to be superior to other enzymatic-based systems. Moreover, this cascade avoided the use of toxic reducing agents and organic solvents. Finally, a new scalable electro-driven platform was developed to synthesize deuterated piperidines in vitro. This new platform used electrical energy to generate H2 and O2. Both gases were transferred via a gas-permeable membrane into a mini flow reactor with immobilized enzymes. H2 and O2 served as electron mediators to produce deuterated methylated piperidines from diamines, with up to 99% conversion yield and excellent regioselective labeling. The platform was scaled up to 300 mL, which resulted in a yield of up 68 mg of isolated product. This work opens the door for implementing electrical energy to drive redox-enzymatic reactions to access fine chemicals.
Die H2-getriebene Cofaktor-Regeneration ist kostengünstig, 100% atomar effizient, und sie wurde in verschiedenen biotechnologischen Ansätzen sowohl in vivo als auch in vitro angewandt. Bislang wurde die H2-getriebene Cofaktor-Regeneration nur bei biokatalytischen Reaktionen mit NADH angewandt. Die H2-getriebene Kofaktor-Regeneration wurde auch nie in multi-enzymatischen Kaskaden oder unter Verwendung anderer Kofaktoren außer NADH eingesetzt. In dieser Arbeit wurde die Anwendung von molekularem H2 zur Steuerung multienzymatischer Kaskaden und biokatalytischer Redoxreaktionen mit anderen Kofaktoren als NADH demonstriert. Der entscheidende Schlüssel zum Erreichen dieses Ziels war die Anwendung der O2-toleranten NAD+-Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 (SH). Zunächst wurde die Effizienz von SH bei der Reduktion von Flavinen sowohl für FMN als auch für FAD nachgewiesen. Die SH wurde dann mit dem alten gelben Enzym (TsOYE) für die H2-getriebene Reduktion von Enoaten gekoppelt, was bis zu 22 mM Produkt ergab. Die O2-Toleranz des SH wurde dann durch Kopplung des SH mit der Styrol-Monooxygenase (StyA), das O2 als Co-Substrate verwendet, nachgewiesen, um die Epoxidation von Styrol voranzutreiben, was 1 mM Styroloxid ergab. Die H2-getriebene Flavin-Regeneration wurde zur Erzeugung von H2O2 durch Entkopplung der reduzierten FMN mit molekularem O2 verwendet. Das erzeugte H2O2 wurde als Substrat für unspezifische Peroxygenase (UPO) verwendet, um organische Verbindungen zu hydroxylieren, was bis zu 4,8 mM an hydroxyliertem Produkt ergab. Zweitens wurde eine neuartige multi-enzymatische Kaskade entworfen, um methylierte N-Heterozyklen aus Diaminen zu synthetisieren. N-Heterozyklen sind wertvolle Bausteine bei der Synthese verschiedener Pharmazeutika. Die Kaskade bestand aus einer Putrescin-Oxidase Variante (PuOE203G), einer Imin-Reduktase (IRED) und einer NADP+-reduzierenden Hydrogenase (SHE341A/S342R). Methylierte N-Heterozyklen wurden mit bis zu 97% Umwandlungsausbeute und >73% ee synthetisiert. Das verwendete H2-basierte Regenerationssystem erwies sich als überlegen gegenüber anderen enzymatischen Systemen. Darüber hinaus konnte bei dieser Kaskade auf den Einsatz von toxischen Reduktionsmitteln und organischen Lösungsmitteln verzichtet werden. Schließlich wurde eine neue skalierbare elektrogetriebene Plattform entwickelt, um deuterierte methylierte Piperidinen in vitro zu synthetisieren. Die neue Plattform nutzte die elektrische Energie zur Erzeugung von H2 und O2. Beide Gase wurden über eine gasdurchlässige Membran in einen Durchfluss-Minireaktor mit immobilisierten Enzymen überführt. H2 und O2 dienten als Elektronenvermittler, um deuterierte methylierte Piperidinen aus Diaminen herzustellen, die eine bis zu 99% Umwandlungsausbeute und eine ausgezeichnete regioselektive Markierung ergaben. Die Plattform wurde auf bis zu 300 mL skaliert, was zu einer Ausbeute von bis zu 68 mg isoliertem Produkt führte. Diese Arbeit öffnet die Tür für die Implementierung der elektrischen Energie zur Durchführung von Redox-enzymatischen Reaktionen, um Feinchemikalien zu produzieren.