Stahl, UlfKuschinsky, Anja2015-11-202006-03-012006-03-012006-03-01urn:nbn:de:kobv:83-opus-12283https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1601http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1304Das Transposon Assisted Signal Trapping (TAST) ist eine einfache Methode der Identifizierung apoplastischer Proteine aus regenerierten Protoplasten von Arabidopsis thaliana. Prototoplasten bilden während ihrer Regeneration eine neue Zellwand aus, wobei sie eine sehr aktive Zellwandsynthese aufweisen. Achtzig Prozent der isolierten Gene konnten durch das bioinformatische Programm SignalP auf Proteinbasis als apoplastisch identifiziert werden. Eine Expressionsanalyse zeigte, dass die zellwandspezifischen Gene in den ersten Stunden der Regeneration, die höchsten Expression aufwiesen. Anhand einiger Beispielgene (At3g13520, At4g19810, At4g24780, At4g31840) konnte die Lokalisation im Apoplasten durch die Fusion mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) nachgewiesen werden. Außerdem wurde die Funktion eines Genes, das möglicherweise an der Zellwandbiosynthese beteiligt ist, an einer Arabidopsis thaliana T-DNA Knockout Mutante untersucht. Es ließ sich nachweisen, dass die T-DNA Insertion im UGE3-Gen (UDP-Glukose Epimerase), einem Gen des Nukleotidzucker-Synthesewegs, erfolgt war. Die Mutante zeigt eine starke Verkürzung der Wurzellänge. Die Zellwandmonosaccharide dieser Mutante unterschieden sich nicht vom Wildtyp. Hingegen konnten Unterschiede in der Zusammensetzung der Arabinogalaktan-Proteine der Wurzelzellwand festgestellt werden. Eine chemische oder genetische Komplementation der uge3 Mutante war nicht möglich. Es wird gefolgert, dass die T-DNA- Insertion nicht für das verkürzte Wurzelwachstum verantwortlich ist.The transposon assisted signal trapping (TAST) is an easy and fast method to identify apoplastic proteins from regenerated protoplasts of an Arabidopsis thaliana cell suspension culture. Since protoplasts have no cell walls, but are able to regenerate a new wall they are useful for examining cell wall biosynthesis. Eighty percent of the isolated genes were predicted by the bioinformatic program SignalP on protein level to be apoplastic. The expression analysis showed that the cell wall specific apoplastic proteins are expressed in the first hours of regeneration when the cell wall was built up. The ability to select apoplastic proteins with the TAST system was proven by testing several candidate genes (At3g13520, At4g19810, At4g24780, At4g31840) by the fusion to the Green Fluorescent Protein (GFP). To test the function of a gene possibly involved in the cell wall synthesis an Arabidopsis thaliana T-DNA knock-out mutant was isolated. It came out that the T-DNA insertion occurred in the nucleotide sugar forming gene UGE3 (UDP-glucose epimerase). The mutant plants showed a reduction in root length. No significant differences in the monosaccharide composition of the cell wall were found between wild type and mutant plants whereas in the arabino galactan proteins of the mutant root cell walls showed differences. A chemical or genetical complementation of the uge3 mutant was not possible. It is concluded that the T-DNA insertion did not cause the phenotype of root shortage.de580 Pflanzen (Botanik)Apoplastische ProteineArabidopsis thalianaNukleotidzuckerTASTZellwandbiosyntheseApoplastic proteinsArabidopsis thalianaCell wall biosynthesisNucleotide sugarsTASTDoctoral Thesis