Bannert, NorbertWamara, Jula2020-07-032020-07-032020https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/11093http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-9983HERV-K(HML-2) ist das jüngste und am besten erhaltene humane endogene Retrovirus. Menschliche Zellen, die diese Viren alle im Genom tragen sind in der Lage funktionelle virale Hüllproteine zu exprimieren. Diese Proteine können andere Retroviren pseudotypisieren und ihren Zelltropismus dadurch verändern. Wichtige Charakteristika des Eintrittprozesses, der durch das Hüllprotein von HERV-K(HML-2) vermittelt wird, sind noch unbekannt und wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von pseudotypisierten lentiviralen Reporterviren analysiert. Als HERV-K(HML-2)-Hüllprotein wurde eine zuvor rekonstituierte Sequenz von HERV-K113 verwendet. Im Fokus der Untersuchungen stand die Identifizierung der Domäne des Hüllproteins, die an den noch unbekannten Rezeptor bindet. Dafür wurde durch einen in silico-Vergleich mit Sequenzen verwandter β-Retroviren zunächst eine putative Rezeptorbindestelle gefunden. Durch gezielte Mutagenese wurde dieser Bereich mehrfach modifiziert. Die mutierten Hüllproteine waren nicht mehr in der Lage, den Zelleintritt der Viren zu gewährleisten oder verminderten ihn erheblich, was in Übereinstimmung mit einer Rezeptorbindungsfunktion dieser Proteinregion steht. Nachfolgend wurde der Versuch unternommen, durch Austausch der gefundenen Rezeptorbindedomäne von HERV-K(HML-2) gegen die des nahen verwandten MMTV, den Virustropismus zu verändern. Die chimären Proteine wurden jedoch nicht in Retroviren eingebaut. In einem weiteren Ansatz wurden lösliche Versionen der rezeptorbindenden SU-Einheit des HERV-K(HML-2)-Hüllproteins als Fusionsprotein mit einer C-terminalen Immunglobulindomäne hergestellt. Als Kontrolle wurden homologe Proteine mit Hüllproteinen anderer Retroviren kloniert und augereinigt. In einer Reihe von Experimenten konnte die spezifische Bindung dieser Proteine an einen zellulären Rezeptor in permissiven Zellen nachgewiesen. In einem proof-of principle Experiment wurde dann die Möglichkeit zur Kopräzipitation des unbekannten Rezeptors von HERV-K(HML-2) mit Hilfe dieser Fusionsproteine gezeigt. Im Zuge der Arbeit wurde der Rezeptor noch nicht isoliert. Die Herstellung und erfolgreiche Charkterisierung der SU-Ig-Fusionsproteine leistet dazu aber eine sehr aussichtsreiche und wichtige Voraussetzung.HERV-K(HML-2) is the youngest and best-conserved human endogenous retrovirus. Human cells, which are carrying these viruses in their genome, can express functional viral envelope proteins. These proteins can be used for pseudotyping other retroviruses and therefore for changing their cell tropism. In the present work, important characteristics of the entry process mediated through the envelope protein of HERV-K(HML-2), which are still unknown, were analysed using pseudotyped lentiviral reporter viruses. A previously reconstituted sequence of HERV-K113 was used as an HERV-K(HML-2) envelope protein. This study focused on finding the domain of the envelope-protein that binds to the yet unknown receptor. To achieve this, an in silico comparison with protein sequences of closely related Betaretroviruses was performed. This comparison allowed a prediction of a putative receptor binding site, which then underwent site-directed mutagenesis leading to several modifications within the region. The generated envelope mutants were either unable to mediate the cell entry of the viruses or did it in a heavily depleted manner, indicating the receptor binding role of the region. In order to alter the virus tropism, we interchanged the then found receptor binding domain of HERV-K(HML-2) with that of the most closely related MMTV, but the chimeric proteins couldn’t be incorporated into the retroviruses. A further approach consisted of expressing a soluble version of the receptor binding subunit of HERV-K(HML-2) envelope protein as a fusion protein with a C-terminal immunoglobulin domain. As control, homologous proteins based on envelope proteins from other retroviruses were cloned and affinity-purified. In a series of experiments, the specific binding of the proteins on a cellular receptor in permissive cells could be demonstrated. In a proof-of principle experiment, the possibility of a precipitation of the unknown receptor of HERV-K(HML-2) by using the fusion proteins was shown. In the course of this work, the receptor has not yet been isolated. The production and successful characterization of SU-Ig- fusion proteins supply however a promising and important requirement for future attempts.de570 Biowissenschaften; BiologieRetrovirenHumane Endogene RetrovirenHERV-K(HLM-2)HIVVirus-Like-PartikelRezeptorenRezeptorbindestelleHüllproteinEnvMutationstudienInterferenzstudienFusionsproteinProteinaufreinigungfunktionelle Untersuchungretroviruseshuman endogenous retrovirusesvirus-like particlesreceptorsreceptor binding siteenvelope proteinmutation studiesinterference studiesfusion proteinprotein purificationfunctional analysisDoctoral Thesis