Melchers, FritzKnoll, Marko2015-11-202012-12-172012-12-172012-12-17urn:nbn:de:kobv:83-opus-37693https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3740http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3443MicroRNAs regulieren komplexe Genexpressions Programme von Zellen auf post-transkriptionaler Ebene. Ich habe gefunden, dass miR-128a, 221 und 222 in zwei nah ver-wandten Stadien der B-Zellentwicklung in der Maus unterschiedlich exprimiert sind: hoch in Pax5-/- CD19- pro/präB Zellen und niedrig in Pax5+/+ CD19+ präB-I Zellen. Die Ex-pression von miR-221 und 222, aber nicht die von 128a, wird durch Pax5 Expression kon-trolliert. Überexpression von diesen miRNAs in Wildtyp präB-I durch Transduktion mit LTR deletierten SIN-retroviralen Vektoren, kontrolliert durch einen tet-induzierbaren Promotor, ändert weder die CD19 Expression noch die Unfähigkeit sich in T Zellen zu entwickeln. Jedoch können, nach Transplantation in Immun-defiziente Rag1-/- Mäuse, miR-221, aber nicht miR-222 transduzierte und induzierte Zellen nun wie pro/präB Zellen ins Knochenmark wandern. Die transplantierten, miR-221 exprimierenden Zellen verlassen das Knochenmark, wenn die Expression durch die Entfernung vom Doxycyclin im Trink-wasser beendet wird. Zwei Gene, Integrin α4 und Syndecan 4, die bei Zelladhäsion und Zellwanderung eine Rolle spielen, konnten als potentielle direkte oder indirekte Ziele für die miR-221 identifiziert werden. Zusammen mit einer Immunglobulin (Ig) schweren μ Kette bilden die Proteine λ5 und VpreB den Prä-B-Zell Rezeptor. In Zusammenarbeit mit Kazuo Ohnishi und Yuki Yana-gisawa habe ich λ5-/- / VpreB1-/- / VpreB2-/- Abelson Virus transformierte präB Zelllinien etabliert und diese mit λ5 und VpreB Genen in Wildtyp form oder mit Nicht-Ig Teil dele-tierten Genen transduziert. Immer, wenn Prä-B-Zell Rezeptoren mit Nicht-Ig deletierten λ5 Genen transduziert wurden, war die Oberflächenablagerung von Prä-B-Zell Rezeptoren erhöht, während das Entfernen der Nicht-Ig Teile von VpreB die Ablagerung verringerten. Die durch anti-μ-schwere Ketten Antikörper stimulierte Phosphorylierung von Syk, SLP65 oder PLC-γ2 und die Calcium Mobilisierung aus intra-zellulären Speichern war abhängig von der Menge an Prä-B-Zell Rezeptoren auf der Oberfläche. Aus diesen Ergebnissen schliesse ich, dass die VpreB Komponente die Fitness von neu generierten schweren V Domänen von Ig-schweren Ketten für das spätere Paaren mit Ig-leichten Ketten sondiert, und der nicht-Ig Teil den Prä-B-Zell Rezeptor auf der Oberfläche der prä-B Zelle fixiert. Im Unterschied dazu vernetzt der Nicht-Ig Teil der λ5 Komponente den Prä-B-Zell Re-zeptor wodurch dieser internalisiert wird, und die Zellen zur Proliferation stimuliert wer-den.MicroRNAs regulate sets of gene expression programs of cells on posttranscriptional levels. I found miR-128a, 221 and 222 differentially expressed at two closely related stages of B-cell development in the mouse, high in Pax5-/- CD19- pro/preB cells and low in Pax5+/+ CD19+ preB-I cells. Expression of miR-221 and 222, but not of 128a, is controlled by Pax5 expression. Over-expression of either of these miRNAs in wild type preB-I cells by transduction with an LTR-defective SIN-retroviral vector under the control of a tet-inducible promotor does not change their CD19 expression, nor their inability to develop to T cells. However, upon transplantation into immune-deficient Rag1-/- mice preB-I cells transduced with miR-221 and induced with doxycycline, but not those transduced with miR-222, gain the capacity of pro/preB cells to home to the bone marrow. The transplanted, miR-221 expressing cells leave the bone marrow when the expression of miRNA is terminated by the removal of doxycycline. Two migration-related genes, encoding integrin α4 and syndecan 4 are potential direct or indirect targets for the miR-221 dependent regulation of retention of pro/preB cells in bone marrow. The VpreB and λ5 proteins, together with Igμ-H chains form preB cell receptors (preBCRs). In collaboration with Kazuo Ohnishi and Yuki Yanagisawa I established λ5-/- / VpreB1-/- / VpreB2-/- Abelson virus transformed cell lines and reconstituted these cells with λ5 and VpreB in wild type form or with deleted non-Ig parts. Whenever preBCRs had the non-Ig part of λ5 deleted, surface deposition was increased, while deletion of VpreB non-Ig part decreased it. The levels of phosphorylation of Syk, SLP65 or PLC-γ2, and of Ca2+ mobilization from intracellular stores, stimulated by μH chain cross-linking antibody, were dependent on the levels of surface-bound preBCRs. It appears that VpreB probes the fitness of newly generated VH-domains of IgH chains for later pairing with IgL chains and its non-Ig part fixes the preBCRs on the surface. By contrast the non-Ig part of λ5 cross-links preBCRs for down-regulation and stimulation.en570 Biowissenschaften; BiologieB-ZellenErsatz leichte KetteMigrationMikroRNAsSignalweiterleitungB-cellHomingMicroRNAsSignallingSurrogate light chainDoctoral Thesis