Lauster, RolandReijo Pera, ReneeDurruthy-Durruthy, Jens2015-11-202014-06-022014-06-022014-03-19urn:nbn:de:kobv:83-opus4-49012https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4288http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3991Die Unzulänglichkeit von humanen Keimzellen während der Embryonalentwicklung haben Studien über dieselbigen bisher vor eine Herausforderung gestellt. Einige Veröffentlichungen haben zwar gezeigt, dass humane Keimzellen aus pluripotenten Stammzellen in vitro differenziert werden können, allerdings war dies in vivo bisher nicht erfolgreich. In dieser Arbeit haben wir in einleitenden Untersuchungen die Genexpression von kürzlich neu entdeckten Genen während der Zellreprogrammierung auf Einzell-Ebene erforscht. Weiterführend haben wir getestet, ob mRNA Reprogrammierung in Kombination mit Xenotransplantation eine durchführbare Strategie für die Untersuchung der humanen Keimzellentwicklung aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) ist. Wir produzierten integrationsfreie iPSCs mit Hilfe der mRNA-basierten Reprogrammierung entweder mit OCT3/4, SOX2, KLF4 und cMYC (OSKM) oder in Kombination mit einer spezifischen Keimzellmarker-mRNA, VASA (OSKMV). Alle iPSC Linien erfüllten die Kriterien für ihren pluripotenten Phenotyp. Desweiteren haben globale Genexpressionsanalysen zwischen OSKM und OSKMV hergestellten iPSCs nicht unterscheiden können. Nur geringe Unterschiede wurden hinsichtlich der Genexpression von keimzellspezifischen Genen, epigenetische Profilen und in vitro Studien entdeckt. Demgegenüber zeigten beide Linien (OSKM und OSKMV) signikante Unterschiede hinsichtlich ihres Differenzierungspotentials, als sie direkt in die Samenkanälchen von immungeschwächten Mäusen transplantiert wurden, deren endogene Keimzellen zerstört wurden. Transplantation der undifferenzierten Stammzelllinien resultierte in morphologisch und immunohistochemisch erkennbare Keimzellen in vivo, insbesondere im Fall von OSKMV Zellen. Dabei ist hervorzuheben, dass OSKMV Zellen, die außerhalb der Samenkanälchen verblieben waren, im Gegensatz zu OSKM Zellen, keine Tumore bildeten. Letztere proliferierten unkontrolliert und formten Tumore. Die Resultate zeigen, dass mRNA Reprogrammierung in Kombination mit Zelltransplantation eine brauchbare Strategie hinsichtlich genetischer Analysen der humanen Keimzellentwicklung ist. Zusätzlich können sie hilfreich für Studien sein, die die Wiederherstellung der Fruchtbarkeit von Männern untersuchen.Studies of human germ cell development are limited in large part due to inaccessibility of germ cells during development. Moreover, although several studies have reported differentiation of mouse and human germ cells from pluripotent stem cells in vitro, differentiation of human germ cells from pluripotent stem cells in vivo has not been reported. Here, we investigate in preliminary studies dynamic gene expression changes of recently discovered novel genes during nuclear cell reprogramming on a single cell level. We then test whether mRNA reprogramming in combination with xeno-transplantation may provide a viable system to probe the genetics of human germ cell development via use of induced pluripotent stem (iPS) cells. For this purpose, we derived integration-free iPS cells via mRNA-based reprogramming with OCT3/4, SOX2, KLF4 and cMYC alone (OSKM) or in combination with the germ cell specific mRNA, VASA (OSKMV). All iPS cell lines met classic criteria of pluripotency. Moreover, global gene expression proling did not distinguish between undifferentiated OSKM and OSKMV iPS cells and only subtle differences were observed in expression of germ cell specific genes, epigenetic profiles and in vitro differentiation studies. In contrast, transplantation of undifferentiated iPS cells directly into the seminiferous tubules of germ cell-depleted immunodecient mice revealed divergent fates of iPS cells produced with different factors. Transplantation resulted in morphologically and immunohistochemically recognizable germ cells in vivo, particularly in the case of OSKMV cells. Significantly, OSKMV cells also did not form tumors while OSKM cells that remained outside the seminiferous tubule proliferated extensively and formed tumors. Results indicate that mRNA reprogramming in combination with transplantation is a viable strategy for genetic analysis of human germ cell development and may inform studies of fertility restoration in men.en570 Biowissenschaften; BiologieInduzierte pluripotente StammzellenReprogrammierungKeimzellenGMPneue GeneInduced pluripotent stem cellsgerm cellsreprogrammingmRNAGMPnovel genesDoctoral Thesis