Lang, ChristineBöttner, Mewes2015-11-202004-11-262004-11-262004-11-26urn:nbn:de:kobv:83-opus-7488https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1144http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-847In der vorliegenden Arbeit wurde ein System entwickelt und angewandt, um Pichia pastoris Expressionsklone für humane cDNAs im Hochdurchsatzverfahren hinsichtlich ihrer Expression zu überprüfen und zu klassifizieren. Im weiteren wurden die mit diesem Verfahren erstellten Expressionsklone auf sequenzbasierte Parameter untersucht, die mit der Expressionshöhe korrelieren. Die entwickelte Methode erlaubt die Anzucht und Induktion der Proteinexpression im 2 mL Maßstab. Der Aufschluss der Zellen erfolgt chemisch in SDS-PAGE Probenpuffer, so dass das Lysat direkt in eine Gelelektrophorese eingesetzt und mittels Western-Blot auf das Vorhandensein des rekombinanten Proteins überprüft werden kann. Die so erstellten Klone wurden entsprechend der beobachteten Expressionshöhe in vier Kategorien eingeteilt. Ungerichtete Untersuchungen auf eine Sortierung der Sequenzen anhand von nicht vordefinierten Sequenzmerkmalen in phylogenetischen Bäumen oder gemeinsamen Motiven ergaben keine Merkmale, die sich bestimmten Kategorien der Expressionshöhe zuordnen lassen. Die Analyse der Verteilung bestimmter Sequenzmerkmale auf die Kategorien der Expressionshöhe ergab einen signifikanten Zusammenhang zwischen einer guten Expression eines Proteins und einem geringen Gehalt an AT-reichen Bereichen in der codierenden Sequenz. Ein hoher Gehalt führt möglicherweise zu einer frühzeitigen Termination der Transkription durch Hefe an solchen AT-reichen Bereichen. Eine genaue Zuordnung von Hefe-Terminationssignalen zu den Sequenzen ist aufgrund der variablen Natur dieser Signale in Hefe nicht möglich. Ein weiterer Zusammenhang wurde zwischen einer nicht detektierbaren Expression und einem hohen isoelektrischen Punkt des Proteins beobachtet. Im Zusammenhang mit dem Phänomen, dass sowohl in Pro- als auch in Eukaryonten cytosolische Proteine einen relativ niedrigen pI aufweisen, könnte das ein Hinweis auf einen regulatorischen Mechanismus sein. Es konnte gezeigt werden, dass durch einen vergleichenden Ansatz Parameter identifiziert werden können, die signifikant mit der Expressionshöhe von Proteinen zusammenhängen. Die Ergebnisse ermöglichen Schlüsse für eine Veränderung von Sequenzen für eine bessere Exprimierbarkeit bzw. eine Vorauswahl von Proteinen zur Expression in P. pastoris.de620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete TätigkeitenPichia pastoris Proteinexpression Hochdurchsatz Sequenzparameter EinflussgrößenDoctoral Thesis