Loading…
Entwicklung und Anwendung einer neuartigen Methode zur Identifizierung von Back- und Brauhefen mittels MALDI-TOF-MS und der multivariaten Datenanalyse
Becke, Jana Hildegard
Für die Brau- und Backwarenindustrie sind die Hefearten S. cerevisiae und S. pastorianus (ssp. S. carlsbergensis) essentielle Mikroorganismen für die Herstellung von Bier- und Backwaren. Zur Erstellung spezifischer Protein-Fingerprints werden häufig die ribosomalen Hefeproteine untersucht. Sie werden konstitutiv exprimiert und eignen sich daher gut für die Analytik [131]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist deshalb eine chemische Probenaufarbeitungsmethode entwickelt worden, mit der innerhalb von 25 Minuten Hefeproteine extrahiert werden und an der MALDI-TOF-MS gemessen werden können.
Iterativ sind verschiedene Targets, Matrices sowie unterschiedliche Lösungsmittel- und Analyten-Verhältnisse getestet worden. In Kombination mit der entwickelten Probenaufarbeitung und der verwendeten Matrix a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wird das Probenmaterial im reverse thin layer Verfahren auf ein hochpoliertes Stahltarget aufgetragen. In einer notwendigen Adaption und Weiterentwicklung bereits etablierter diagnostischer Methoden wurden die Parameter an dem MALDI-TOF-MS angepasst. Die Messungen am MALDI-TOF-MS sind im positiven linearen Modus mit einem Nd/YAG Laser im Massenbereich von 2000,36-12999,34 Da durchgeführt worden.
Durch die Kombination der mathematischen Verfahren PCA und SIMCA konnten die Protein-Fingerprints, der 11 Kulturhefestämme der Arten S. cerevisiae, S. pastorianus sowie der Fremdhefen S. diastaticus und Pichia membranifaciens, für eine Differenzierung der verschiedenen Wachstumsstadien eines Hefestammes genutzt werden. In Abhängigkeit von dem eingesetzten Nährmedium ist eine Differenzierung der Hefearten S. cerevisiae, S. pastorianus, S. diastaticus und Pichia membranifaciens auf Stammebene möglich gewesen. Auf Artebene war eine vollständige Differenzierung sowohl im SD-Medium und den Vollmedien möglich.
Anhand spezifischer Protein-Fingerprints der Art S. cerevisiae konnten in weiteren Versuchen die beiden Prozessstufen der Stell- und Versandhefefermentation differenziert werden. Ebenfalls war eine Differenzierung der unterschiedlichen Erntehefen verschiedener Fermentationszyklen der Art S. pastorianus (ssp. carlsbergensis) möglich. Zur Überprüfung der Forschungsergebnisse wurde die etablierte molekularbiologische PCR-Methode mit spezifischen δ12/δ21-Primern angewendet.
For the brewing and bakery industry, the yeast species S. cerevisiae and S. pastorianus (ssp. S. carlsbergensis) are essential microorganisms in the production process. For creating specific protein fingerprints, the ribosomal yeast proteins are often investigated. They are constitutively expressed and are therefore well suited for analysis [131].
In the present work, a chemical sample processing method for extracting yeast proteins within 25 minutes has been developed allowing measurement by MALDI-TOF-MS. Iteratively, various targets, matrices and different solvent and analyte ratios have been tested. In combination with the developed sample preparation and the used matrix a-cyano-4-hydroxycinnamic acid the sample material is applied on a highly polished steel target in the reverse thin layer process. In a necessary adaptation and further development of already established diagnostic methods, the parameters of the MALDI-TOF-MS were adapted. The measurements on the MALDI-TOF-MS were carried out in the positive linear mode with a Nd/YAG laser in the mass range of 2000.36-12999.34 Da.
By combining the mathematical methods PCA and SIMCA, the protein fingerprints of the 11 strains of S. cerevisiae, S. pastorianus and the foreign yeasts S. diastaticus and Pichia membranifaciens could be used to differentiate the different growth stages of a yeast strain. Depending on the nutrient medium used, successful differentiation of the yeast species S. cerevisiae, S. pastorianus, S. diastaticus and Pichia membranifaciens has been possible at the strain level. At the species level, complete differentiation was possible in both synthetic defined media and full media. On the basis of specific protein fingerprints of the species S. cerevisiae, the two process stages of Stellhefefermentation and Versandhefefermentation could be differentiated in further experiments. It was also possible to differentiate the different harvest yeast samples of the various fermentation cycles of the species S. pastorianus (ssp. carlsbergensis). To verify the research results, the established molecular biology PCR method with specific δ12/δ21 primers was applied.
